茶树CsSPI和灰茶尺蠖EgGL的基因克隆和功能研究

发布时间：2021-05-21 14:26

　　植物丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine proteinase inhibitor,SPI）具有重要的抗病虫功能,但其在茶树上的抗病虫功能研究尚未见报道。灰茶尺蠖Ectropis grisescens不仅是茶尺蠖Ectropis obliqua的近缘种,也是茶业生产的主要害虫之一。有关茶树不同品种对灰茶尺蠖的抗性研究较少,而植食性昆虫唾液激发子在植物防御反应中发挥了重要作用。研究茶树丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的抗病虫功能及灰茶尺蠖葡萄糖苷酶在茶树诱导防御反应中的作用,可为今后茶树抗性品种的选育、灰茶尺蠖与茶树之间的协同进化关系等研究提供科学依据。本论文通过基因克隆的方法获得了茶树丝氨酸蛋白酶抑制剂基因和灰茶尺蠖葡萄糖苷酶基因,并对这两个基因的表达特征进行了分析。通过昆虫各生长发育指标测定了茶树不同品种中丝氨酸蛋白酶抑制剂的活性和丝氨酸蛋白酶抑制剂SPI的抗虫功能。采用RNA干扰技术,构建了L4440-EgGL重组表达载体。研究结果如下:（1）通过RT-PCR技术克隆获得了全长为1669bp的茶树CsSPI基因,包含一个1170bp的最大开放阅读框,编码389个氨基酸残基组成的多肽,理论分子质量... 

【文章来源】：东北林业大学黑龙江省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：61 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 绪论
    1.1 植物蛋白酶抑制剂研究进展
    1.2 鳞翅目昆虫唾液中与植物防御反应相关的激发子（抑制子）种类、功能及研究现状
    1.3 植食性昆虫葡萄糖苷酶在植物诱导防御反应中的作用及研究进展
    1.4 研究目的、意义和研究内容
2 茶树丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆、表达
    2.1 材料与方法
        2.1.1 仪器设备
        2.1.2 供试试剂
        2.1.3 供试材料
        2.1.4 引物设计
        2.1.5 茶树Total RNA提取
        2.1.6 cDNA第一链的合成
        2.1.7 Luria-Bertani培养基的制备
        2.1.8 PCR扩增
        2.1.9 DNA的凝胶回收
        2.1.10 纯化加A
        2.1.11 连接T载体
        2.1.12 大肠杆菌的热击转化
        2.1.13 菌落PCR
        2.1.14 CsSPI基因表达分析
        2.1.15 数据分析方法
    2.2 结果与分析
        2.2.1 CsSPI基因PCR扩增
        2.2.2 CsSPI的理化性质
        2.2.3 CsSPI的结构分析
        2.2.4 实时荧光定量PCR反应条件的确定
        2.2.5 CsSPI的表达特征分析
    2.3 讨论
3 不同茶树品种胰蛋白酶抑制剂及抗性分析
    3.1 材料与方法
        3.1.1 仪器设备
        3.1.2 供试试剂
        3.1.3 供试材料
        3.1.4 茶树蛋白酶抑制剂活性的测定
        3.1.5 生物量测定
        3.1.6 数据分析方法
    3.2 结果与分析
        3.2.1 不同茶树品种胰蛋白酶抑制剂活性的测定
        3.2.2 不同茶树品种对灰茶尺蠖幼虫体重的影响
        3.2.3 不同茶树品种对灰茶尺蠖幼虫死亡率、化蛹率、成虫羽化率的影响
        3.2.4 不同茶树品种对灰茶尺蠖幼虫期和蛹的影响
    3.3 讨论
4 灰茶尺蠖葡萄糖苷酶基因EgGL的克隆和生物信息学分析
    4.1 材料与方法
        4.1.1 仪器设备
        4.1.2 供试试剂
        4.1.3 供试材料
        4.1.4 引物设计
        4.1.5 灰茶尺蠖幼虫Total RNA提取
        4.1.6 cDNA第一链的合成
        4.1.7 Luria-Bertani培养基的制备
        4.1.8 PCR扩增
        4.1.9 DNA的凝胶回收
        4.1.10 纯化加A
        4.1.11 连接T载体
        4.1.12 大肠杆菌的热击转化
        4.1.13 菌落PCR
        4.1.14 数据分析方法
    4.2 结果与分析
        4.2.1 EgGL基因PCR扩增
        4.2.2 EgGL基因序列分析
        4.2.3 EgGL蛋白质的理化性质
        4.2.4 EgGL序列的结构分析
        4.2.5 EgGL序列的同源性比对
    4.3 讨论
5 L4440-EgGL重组表达载体的构建与转化
    5.1 材料与方法
        5.1.1 仪器设备
        5.1.2 供试试剂
        5.1.3 供试材料
        5.1.4 大肠杆菌DH5α 感受态细胞的制备
        5.1.5 重组质粒的筛选与鉴定
        5.1.6 L4440-EgGL重组表达载体的构建
        5.1.7 大肠杆菌HT115（DE3）表达ds RNA
        5.1.8 EgGL基因表达分析
        5.1.9 数据分析方法
    5.2 结果与分析
        5.2.1 灰茶尺蠖EgGL基因的表达模式分析
        5.2.2 L4440载体的获得与鉴定
        5.2.3 表达EgGL dsRNA目的片段的选择与获得
        5.2.4 L4440-EgGL在大肠杆菌HT115（DE3）中的鉴定
    5.3 讨论
6 结论
    6.1 总结
    6.2 展望
参考文献
攻读学位期间发表的学术论文
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]不同茶树品种对假眼小绿叶蝉的抗性[J]. 金珊,孙晓玲,陈宗懋,肖斌.  中国农业科学. 2012(02)
[2]昆虫唾液成分在昆虫与植物关系中的作用[J]. 殷海娣,黄翠虹,薛堃,王戎疆,闫凤鸣.  昆虫学报. 2006(05)
[3]Induction of nicotine in tobacco by herbivory and its relation to glucose oxidase activity in the labial gland of three noctuid caterpillars[J]. ZONG Na1,2 & WANG Chenzhu1 1.State Key Laboratory of Integrated Management of Insects & Rodents,Institute of Zoology,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100080,China;2.Graduate School of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100080,China Correspondence should be addressed to Wang Chenzhu(e-mail: czwang@ioz.ac.cn).  Chinese Science Bulletin. 2004(15)
[4]花生种子胰蛋白酶抑制剂与抗黄曲霉侵染的关系[J]. 梁炫强,潘瑞炽,周桂元.  作物学报. 2003(02)

硕士论文
[1]家蚕葡萄糖氧化酶基因BmGox的克隆和表达以及序列分析[D]. 程静.西南大学 2011
[2]不同茶树品种对茶尺蠖抗性机制的研究[D]. 郑高云.安徽农业大学 2008



本文编号：3199866