两个VIGS载体沉默大豆内源基因的比较

发布时间：2020-03-30 00:52

【摘要】：大豆(Glycine max)原产于我国,是世界范围内主要油料作物之一。由于大豆转基因效率较低,病毒介导的基因沉默(VIGS)技术已成为在大豆上研究基因功能的关键技术之一。大豆花叶病毒(Soybean mosaic viruss,SMV)病是一种全球性大豆病毒病害,广泛分布于我国各大豆主产区,严重影响大豆的产量与品质。SMV常引发大豆叶片表现花叶和坏死两种症状。通过蛋白组学研究,发现抗坏血酸过氧化物酶(APX)在表现坏死症状的细胞中上调表达。为进一步验证该蛋白在SMV引发大豆叶片症状中的功能,本研究利用VIGS技术沉默了大豆内源APX基因。所用两个VIGS载体均以菜豆豆荚斑驳病毒(BPMV)为基础构建,其中r-BPMV载体为RNA载体,需将RNA转录为DNA才能接种,而p-BPMV载体为DNA载体可直接接种,两个载体的主要区别是后者不需要体外转录过程。通过克隆APX基因保守序列的基因片段,并分别连接入两个BPMV载体中。通过人工摩擦接种方式,使重组载体转入大豆中,分析基因沉默效率,观察基因沉默植株接种SMV后症状表现,明确APX基因在大豆抗大豆花叶病毒中的作用。结果表明,r-BPMV载体构建成功,但接种到叶片后叶片未表现花叶症状,并且未检测到大豆花叶病毒外壳蛋白(CP)基因的表达。可能是载体的体外转录不稳定导致重组载体没有有效的侵入植物;p-BPMV载体构建成功,接种到两个大豆品种(南农1138-2和浙A8901)后叶片均表现花叶症状,并检测到大豆花叶病毒CP基因的表达。通过qRT-PCR检测基因沉默植株APX基因表达量,结果显示,基因沉默植株APX表达量比接种BPMV空载体(阳性对照)及接种PBS缓冲液(阴性对照)低。证明接种重组载体对沉默内源基因有一定效果。两个大豆品种的基因沉默植株接种SMV后的症状与接种BPMV空载体的阳性对照无显著差异,对接种病毒后CP基因表达量的qRT-PCR及ELISA分析结果表明,CP基因在个别时间点上调表达。以上结果表明APX基因对SMV引发大豆花叶症状的表现没有促进作用。综上所述,试验结果证明r-BPMV载体由于体外转录不稳定,不能有效沉默内源基因,p-BPMV沉默载体对沉默内源基因有一定效果。
【图文】：

图１－１病毒诱导的基因沉默原理图［３５］逡逑Ｆｉｇｕｒｅ．邋１－１邋Ｖｉｒｕｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｇｅｎｅ邋ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ邋ｓｃｈｅｍａｔｉｃ逡逑３逡逑

Ｓｅｑ＿２ｔＧＧＣＥＡＣＭＴＡＴＡＡＣＧＡＧＧＴＧＣＡＡＧ邋９８０逡逑图２－２邋ｒ＿ＢＰＭＶ重组载体与目的基因核苷酸序列比对分析逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｒ－ＢＰＭＶ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ｖｅｃｔｏｒ邋ａｎｄ邋ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ｏｆ邋ｔａｒｇｅｔ逡逑ｇｅｎｅ逡逑注：ＳｅｑＪ表示目的基因序列，Ｓｅｑ＿２表示ｒ－ＢＰＭＶ重组载体基因序列。逡逑Ｎｏｔｅ：邋Ｓｅｑ＿ｌ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ邋ｔｈｅ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｔａｒｇｅｔ邋ｇｅｎｅ，邋ａｎｄ邋Ｓｅｑ＿２邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ邋ｔｈｅ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ逡逑
【学位授予单位】：河北科技师范学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S565.1

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本文编号：2606773