知母甾体皂苷元生物合成关键酶基因克隆及生化研究

发布时间：2020-04-08 01:06

【摘要】：目的:知母,百合科知母(Anemarrhena asphodeloides Bunge)的干燥根茎,是一种传统中药,其主要的药理活性成分是知母皂苷及其苷元,约占知母干燥根茎的6%,种类较多(近50多种)、含量丰富。目前知母皂苷BII对于阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)以及改善学习记忆能力具有明显的效果,已经有了深入的研究,是一个有潜力的抗AD的药物。然而,其具体的生物合成途径及关键酶基因尚不清楚。知母甾体皂苷依靠植化分离不仅成本较高,而且受制于天然药用资源,提取物的质量难以控制。因此本研究挖掘知母皂苷生物合成途径上的关键酶基因,2,3-氧化鲨烯环化酶(2,3-oxidosqualene cyclase,OSC)、甾醇侧链甲基转移酶1(Sterol methyl transferase 1,SMT1)和甾醇侧链还原酶2(Sterol side chain reductase enzyme 2,SSR2),对其进行异源表达和生化功能验证,为知母皂苷合成途径的研究奠定基础。方法:(1)对知母根茎和地上部分进行转录组测序,收集整理番茄中报道的甾体生物碱合成途径中所有的基因序列以及其他主要含有甾体皂苷物种中的转录组数据,通过本地Blast,找到与知母皂苷生物合成所有相关的Unigenes。然后通过在线工具,进行基因开放阅读框分析,找出全长和非全长的序列。对知母皂苷母核合成有关的Unigenes通过qRT-PCR进行表达部位分析,结合候选基因的表达特征与知母主要成分的含量分布特点,进一步预测知母甾体皂苷合成途径的候选基因。(2)克隆知母AaOSC、AaSMT1和AaSSR2候选基因,将AaOSC连接至酵母表达载体pESC-URA和pESC-HIS以及烟草表达载体pEAQ-HT-DEST1,AaSMT1和AaSSR2连接至酵母表达载体pESC-HIS,进行异源表达,利用GC/MS对其表达产物进行分析。(3)将AaOSC和AaSMT1与其他物种中的同源基因利用MEGA软件进行蛋白质序列比对,绘制环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)与甾醇侧链还原酶(Sterol methyl transferase,SMT)的系统进化树,分析其与其他物种的进化关系。(4)利用合成生物学多片段酵母染色体同源重组技术,将2,3-氧化鲨烯合成途径中的关键酶基因以及知母AaOSCR12整合至酵母基因组,进行稳定表达,构建产2,3-氧化鲨烯工程菌和产环阿屯醇酵母工程菌。结果:(1)知母根茎和地上部分转录组测序,找到了与知母皂苷生物合成所有相关的Unigenes共40条,其中与知母皂苷母核合成有关的Unigenes有18条。(2)结合基因差异表达水平与知母皂苷、甾醇代谢含量分析,显示知母皂苷在根中大量积累,与其合成相关的基因也在根中特异性表达;根茎中甾体皂苷的含量远远高于甾醇的含量,说明代谢流在胆固醇-甾体皂苷这条途径上流量很大。(3)AaOSCR12的产物为环阿屯醇,其另一个产物还需进一步分离纯化鉴定结构,确定AaOSCR12为知母环阿屯醇合酶,而AaOSCL6和AaOSCL10无催化活性。AaSMT1催化环阿屯醇产生24-亚甲基环木菠萝烷醇,具有甾醇侧链转移酶1活性。(4)构建了高产2,3-氧化鲨烯酵母工程菌Y2-SE-10和高产环阿屯醇酵母工程菌Y3-AaOSCR12,Y2-SE-10工程菌可以为2,3-氧化鲨烯环化酶的功能验证提供高含量的底物,同时也可以作为优势底盘菌进行下一步基因整合;Y3-AaOSCR12工程菌可以将环阿屯醇的产量提高7.4倍,从而为AaSMT1和AaSSR2基因的功能提供底物支持。结论:本论文挖掘了知母皂苷生物合成途径上的关键酶基因,并克隆鉴定了3条AaOSC基因、1条AaSMT1基因和2条AaSSR2基因,异源表达验证了AaOSCR12为知母环阿屯醇合酶。AaSMT1催化环阿屯醇产生24-亚甲基环木菠萝烷醇,具有甾醇侧链转移酶1活性,此外,还构建了产2,3-氧化鲨烯工程菌Y2-SE-10和产环阿屯醇工程菌Y3-AaOSCR12,为知母皂苷生物合成途径的解析、环阿屯醇合酶催化机制的研究奠定了基础。
【图文】：

甾体皂苷,知母,母核,植物

图 1-1 知母植物及主要的甾体皂苷母核(R1= sugar, H; R2= H, O-glc; R3= H, OH; R4=OH, OCH3; R5= OH, H)1.2 三萜类化合物生物合成途径萜类化合物（类异戊二烯）是由多个异戊二烯（Isoprene，，C5）基本骨架单元以首尾相接的方式聚合而成的含氧衍生物的总称，是植物产生的数量和种类最多的一类化学物质，目前已发现 50,000 多种[10]。而三萜类化合物是一大类由 6个异戊二烯单元（C30）组成的萜类物质，目前已知的三萜化合物约有 2 万余种，三萜类化合物结构复杂且主要来源于植物，还有许多难以通过化学合成的方法获得。此外，少数三萜可以在于除植物之外的其它生物，如有些细菌可以合成鲨烯（squalene）[11]，海参可以合成三萜皂苷[12]。1.2.1 2,3-氧化鲨烯的生物合成

甾醇,三萜,生物合成途径,羊毛甾醇

图 1-2 甾醇和三萜生物合成途径（改编自 Annu. Rev. Plant Biol. 2014[19]，Nature Plants,2016[32]）HMGS：羟甲基戊二酸单酰辅酶 A 合成酶；3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶 A 还原酶；SHC：鲨烯环化酶；SQE：2,3-氧化鲨烯环化酶；LAS：羊毛甾醇合酶；CAS 环阿屯醇合酶；CPQ：葫芦素二烯醇合酶；BAS：beta-香树素合酶。1.2.2.1 甾醇甾醇作为动植物初生代谢产物，微生物，动物，植物均含有甾醇但种类有所差别，真菌类微生物甾醇主要为麦角固醇，其合成前体为羊毛甾醇；动物甾醇主要为胆固醇，合成前体也是羊毛甾醇；植物中则种类更多，如菜油甾醇，谷甾醇，豆甾醇等，都以环阿屯醇为合成前体。2009 年，Ohyama K 等人[33]在双子叶植物中（拟南芥等）鉴定出了羊毛甾醇合酶，说明了羊毛甾醇途径不仅有助于植物甾醇的生物合成，还有助于作为次级代谢产物的类固醇的生物合成。甾醇作为细胞膜的重要组成成分，在信号转导和激素合成方面发挥重要作用，如油菜素甾醇类(brassinosteroids,BRs)作为植物激素，能促进植物茎的伸长和细胞分裂[34]，可能
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S567.239

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