烟草膜蛋白PtBP1在PeaT1诱导抗性中的功能和水稻新型NLR蛋白对的鉴定

发布时间：2020-04-07 23:13

【摘要】：植物的免疫系统本质上可分两个层次。植物可通过其细胞表面的模式识别受体(Pattern Recognition Receptor,PRR)识别微生物相关或病原相关分子模式(Microbial-or PathogenAssociated Molecular Patterns,MAMPs or PAMPs),并诱导免疫反应PTI(PAMP-triggered immunity)的发生。植物还能通过细胞内部抗性基因(Resistance gene,R gene)编码的具有多态性的NLR(Nucleotide binding domain(NBD)and Leucine-rich Repeat)蛋白识别病原体分泌到宿主细胞内的效应因子effector,诱导植物免疫ETI(effector-triggered immunity)的发生。本文从植物免疫PTI和ETI两个层面研究烟草细胞膜蛋白PtBP1在真菌蛋白激发子PeaT1诱导植物系统抗性途径中的作用,以及水稻NLR蛋白对RPR1和RPR2的基因克隆和功能分析。具体的研究结果如下:1.研究明确了烟草膜蛋白PtBP1介导了PeaT1诱导的烟草系统抗病性。利用VIGS基因沉默技术获得了Pea T1互作蛋白PtBP1的基因沉默株,沉默效率达到70%以上。研究PtBP1在PeaT1诱导的系统抗病性中发挥的作用发现,TMV-GFP侵染Pt BP1沉默植株组的叶片病斑数(130.25±19.99)比对照组病斑数(43.25±8.73)提高三倍。Pt BP1沉默组积累的TMV外壳蛋白(TMV-CP)的含量也显著高于TRV阴性对照组。PtBP1的沉默还能阻断PtBP1诱导的抗病相关基因的上调表达。PtBP1的沉默对Pea T1的刺激变得不再敏感,阻断了PeaT1诱导的系统抗性,因而沉默植株更容易感病。PtBP1有可能感知PeaT1的刺激并介导了下游的抗病性信号传递。2.通过生物信息学分析,确定了来源于水稻的NLR蛋白对RPR1和RPR2为本文的研究对象。RPR1和RPR2蛋白对在N-端均包含RX-CC结构域,是典型的CC-NLR(CNL)类型蛋白,其中RPR C-端包含2个WRKY结构域,与来自于拟南芥的NLR蛋白对RPS4/RRS1同源。利用金门克隆技术成功构建了RPR1和RPR2的金门克隆Level-1,Level0,Level1重组载体。3.利用瞬时表达技术确定了RPR1和RPR2定位于植物细胞核,且蛋白对RPR1和RPR2与效应蛋白PopP2共表达产生类HR反应,即注射区域组织表现出缺绿黄化。根据定位模式和识别模式明确了RPR1和RPR2与已报道的拟南芥RPS4/RRS1具有相似性,基于RPS4/RRS1作用机理的前期研究,分析了RPR1和RPR2的功能。真菌蛋白激发子Pea T1在烟草细胞膜上的互作蛋白Pt BP1的研究和NLR蛋白对RPR1和RPR2的研究,都是从分子水平研究植物和病原微生物的相互作用和协同进化的过程。本研究将为真菌蛋白激发子Pea T1诱导植物抗性提供理论基础,将拟南芥RRS1/RRS4的NLR蛋白对“诱饵模型”推广到水稻上,对挖掘水稻抗性基因和转基因抗性育种具有重大的意义。
【图文】：

图 2.1 PtBP1 基因沉默片段的选择。A. PtBP1 和其同源蛋白的氨基酸序列比对分析。B. PtBP1 相似性分析。 C. PtBP1 基因沉默片段的 PCR 扩增Figure 2.1 VIGS DNA fragment selection of PtBP1.（A）Sequence alignment analysis of PtBP1 and irotein.（B）Sequence similarity analysis of PtBP1 and PcaP2.（C）PCR amplification of silencing fragm.3.2 PtBP1 沉默效率检测PtBP1 基因沉默的植株和野生型植株在表型上并没有明显差异。TRV2-PDS 是实对照，从图中可以看到 PDS 植株顶端的叶片有明显的白化症状，而与之相邻的野验组 TRV2-PtBP1 基本无异。如图所示，从左到右依次是野生型、TRV2-PDS 沉默照组，，有白化表型出现）和 TRV2-PtBP1 沉默植株。

图 2.2 本生烟的基因沉默表型Figure 2.2 Phenotype of Nicotiana. Benthamiana of VIGS treatment采用荧光定量PCR的方法检测TRV2-PtBP1沉默植株的PtBP1基因在算基因沉默植株的沉默效率。通过对实验结果分析可知，TRV2-PtBP1相比，PtBP1 的表达量下降了近70%（图5.9）。可认定VIGS基因沉默下来的功能分析和检测。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S511

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本文编号：2618516