水稻早衰突变体es7和pls5基因的图位克隆与功能研究

发布时间：2024-07-11 04:27

　　本研究从实验室的突变体库中,筛选得到两个早衰突变体,分别命名为es7和pls5。随后分别对其开展了表型分析、基因定位与克隆、基因功能分析等相关工作,获得的主要结果如下:1.通过⁶⁰Co辐射诱变93-11种子,筛选得到一个水稻早衰突变体es7。在大田种植条件下,播种60天左右时,下部叶片开始出现衰老,随着植株的生长发育,衰老越来越严重。在高浓度二氧化碳条件下,光呼吸被抑制,es7表型可以得到恢复。生理指标检测分析发现,es7突变体中,有大量H₂O₂积累,并且过氧化氢酶活性显著降低,植株总抗氧化能力降低;同时衰老相关基因表达量都显著升高。图位克隆和测序分析发现,在88kb范围内,第9个ORF(LOC_Os07g46460)的第二个外显子和内含子衔接处(1292bp),有一个碱基发生了突变,由G突变为A,导致mRNA缺失57个碱基,最终导致蛋白保守的purF-type谷氨酰胺转移区域结构异常。ES7基因编码一个铁氧还原蛋白依赖的谷氨酸合酶(Fd-GOGAT),是一个组成型表达的基因,并且其编码的蛋白定位于叶...

【文章页数】：96 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 引言
    1.1 叶片衰老的进程和生理生化变化
        1.1.1 叶片衰老的进程
        1.1.2 叶片衰老生理生化变化
    1.2 叶片衰老相关基因的研究
        1.2.1 叶绿体发育和叶绿素合成相关基因
        1.2.2 叶绿素降解相关基因
        1.2.3 蛋白质合成及降解相关基因
        1.2.4 激素途径相关基因
        1.2.5 其他途径相关基因
    1.3 氮代谢与叶片衰老
        1.3.1 氮代谢与叶片衰老
        1.3.2 谷氨酰胺合酶/谷氨酸合酶循环
        1.3.3 植物中的谷氨酸合酶
        1.3.4 水稻中谷氨酸合酶研究进展
    1.4 磷脂酰丝氨酸及其合成酶研究进展
    1.5 本研究的目的和意义
第二章 水稻早衰突变体es7基因的图位克隆与功能研究
    2.1 实验材料
    2.2 实验方法
        2.2.1 水稻种植条件
        2.2.2 DNA提取
        2.2.3 叶绿素含量测定
        2.2.4 CAT, T-AOC, GS活性测定
        2.2.5 H₂O₂, NO2
-含量测定
        2.2.6 GOGAT活性测定
        2.2.7 GDH活性测定
        2.2.8 候选基因分析
        2.2.9 总RNA提取
        2.2.10 第一链cDNA的合成
        2.2.11 荧光定量PCR
        2.2.12 互补载体构建
        2.2.13 大肠杆菌转化
        2.2.14 水稻遗传转化
        2.2.15 CRISPR/Cas9载体构建
        2.2.16 OsES7-pro::GUS载体构建
        2.2.17 GUS染色
        2.2.18 p35S::ES7-GFP载体构建
        2.2.19 水稻原生质体的制备和瞬时表达
        2.2.20 游离氨基酸含量测定
        2.2.21 酵母双杂交筛选
    2.3 结果与分析
        2.3.1 es7突变体表型分析
        2.3.2 es7突变体生理指标检测
        2.3.3 衰老相关基因表达量检测
        2.3.4 候选基因确定
        2.3.5 ES7的基因克隆和功能验证
        2.3.6 ES7在绿色组织中表达
        2.3.7 ES7定位于叶绿体
        2.3.8 ES7参与氮代谢
        2.3.9 ES7影响叶绿素的合成
        2.3.10 es7突变体在高CO₂条件下可以正常生长
        2.3.11 酵母双杂交文库筛选
    2.4 讨论
        2.4.1 ES7对水稻的正常生长发育起重要作用
        2.4.2 ES7参与氮代谢和氨基酸的代谢
        2.4.3 ES7影响叶绿素的合成
        2.4.4 es7也是一个光呼吸突变体
第三章 水稻早衰突变体pls5基因的图位克隆与功能研究
    3.1 实验材料
    3.2 实验方法
        3.2.1 农艺性状调查
        3.2.2 定位群体构建
        3.2.3 遗传分析
        3.2.4 光合速率测定
        3.2.5 CAT, T-AOC活性和H₂O₂含量测定
        3.2.6 MDA含量测定
        3.2.7 POD测定
        3.2.8 GSH-PX测定
        3.2.9 组织化学分析
        3.2.10 叶片透射电镜观察
        3.2.11 TUNEL实验
        3.2.12 聚丙烯酰胺凝胶电泳
        3.2.13 基因定位
        3.2.14 候选基因分析
        3.2.15 RNA提取和荧光定量PCR
        3.2.16 互补载体构建
        3.2.17 artificial microRNA(amiRNA)载体构建
        3.2.18 p35S::PLS5-GFP载体构建
        3.2.19 水稻原生质体的制备和瞬时表达
        3.2.20 高温诱导衰老
        3.2.21 水稻叶片总蛋白提取
        3.2.22 Western blot
        3.2.23 均一化膜蛋白酵母双杂交cDNA文库构建
        3.2.24 膜蛋白酵母双杂交文库筛选
    3.3 结果与分析
        3.3.1 pls5突变体表型分析
        3.3.2 叶绿素和光合指标测定
        3.3.3 农艺性状考察
        3.3.4 衰老相关生理指标测定
        3.3.5 pls5突变体叶绿体降解加速
        3.3.6 pls5突变体细胞衰老、凋亡加速
        3.3.7 pls5的遗传分析
        3.3.8 基因定位
        3.3.9 候选基因分析
        3.3.10 PLS5基因克隆和功能验证
        3.3.11 PLS5生物信息学分析
        3.3.12 PLS5在水稻中组成型表达
        3.3.13 PLS5蛋白定位于细胞膜和核膜
        3.3.14 PLS5在突变体中表达下调
        3.3.15 PLS5突变可使水稻叶片加速衰老
        3.3.16 高温环境加速pls5衰老
        3.3.17 膜蛋白酵母双杂交文库筛选
    3.4 讨论
        3.4.1 PLS5对于细胞的正常生长起重要作用
        3.4.2 PLS5突变可加速水稻衰老
        3.4.3 PLS5间接影响水稻产量
第四章 全文结论
    4.1 ES7参与氮代谢，影响衰老
    4.2 PLS5突变促进细胞死亡，加速衰老
参考文献
致谢
作者简介



本文编号：4005250

boshi