高粱转录因子SbbHLH1调控木质素合成代谢网络的初步研究

发布时间：2020-04-07 23:03

【摘要】：随着化石能源的日渐枯竭,全球范围内的能源危机正不断加重,因此寻找新的替代能源是今后发展的必由之路。生物能源是可再生、高效清洁的绿色能源,生物燃料乙醇利用植物纤维素为原料经酶解糖化、发酵产生乙醇,可直接按一定比例添加到汽油中作为燃料使用。但木质纤维素原料结构复杂,其中高含量的木质素直接影响了纤维素酶的转化效率,导致纤维素的降解效率降低,这已经成为制约该产业发展的重要因素。甜高粱因因其具有生物量大,抗逆性强、茎秆含糖量高等优点已成为当今世界广泛关注的新型能源作物。通过基因工程改变木质素合成途径中关键基因的表达而调控木质素的合成,适当降低其木质素含量,已成为提高生物乙醇生产技术的重要途径之一。SbbHLH1是高粱木质素合成中的负调控因子(闫丽博士论文,2011),但对其作用机制还缺乏深入的认识。本文通过其与其他转录因子及蛋白质的互作以及靶基因启动子的识别、结合等研究其调控木质素的合成机理。对已经筛选出的两个拟南芥过表达纯系(SbbHLH1-GFP),通过苯丙烷类代谢途径相关Marker基因的表达和Wiesner染色,进一步证明转录因子SbbHLH 1对木质素的合成有负调控作用,未受到GFP对其功能的影响,同时这有利于进一步通过该标签研究该转录因子的表达部位、互作蛋白等信息。通过SbbHLH1-His重组蛋白与野生型甜高粱(S213)茎叶总蛋白、SbbHLH1-GFP过表达拟南芥总蛋白亲和层析-质谱分析(AS-MS),最终从苯基丙烷途径中识别出11个可能的“互作”蛋白,经酵母双杂、BiFC等实验进一步验证,最终找到参与木质素的合成的细胞色素P450(CYP98A3)与SbbHLH1发生互作,因为AtCYP98A3就是木质素代谢途径中的C3H基因,与其互作可能影响其活性,进一步影响木质素的合成;同时SbbHLH1转录因子与靶位点的结合及与其他蛋白的互作、降解也可能受到与C3H结合的影响。本实验通过竞争结合实验进一步确认SbbHLH1转录因子可结合AtPAL1启动子的E-box(CANNTG),同时还发现At4CL1启动子的E-box也可和SbbHLH1结合。这就进一步证明了SbbHLH1转录因子最少通过结合两个苯基丙烷途径中的重要基因E-box,调控木质素的合成(AtPAL1和At4CL1)。对已获得的SbbHLH1转基因毛白杨五年生实生苗,因其为嵌合体,需进一步进行分子检测,对其阳性枝条进行纤维素降解实验,实验结果证明SbbHLH1转基因毛白杨中木质素的降低,有利于纤维素酶对其中纤维素的降解;而且木质素的含量与纤维素的转化率呈显著负相关。该结果为通过基因工程技术创制低木质素含量的杨树等能源植物新品种提供一条有益的途径。
【图文】：

木质纤维素,效应,紧密结构,转化过程

ｉｇ．ｌ邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｆｌｏｗ邋ｓｈｅｅｔ邋ｆｏｒ邋ｔｈｅ邋ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｂｉｏｍａｓｓ邋ｔｏ邋ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ（Ｘｕ邋ｅｔ邋ａｌ，邋２０１纤维素的降解转化过程中（如图ｉ），对原料进行适当的预处理后，，维素和木质素之间的紧密结构，使之松散，加大空隙和容积，有利于解性能（如图２），从而提高纤维素的转化率。逡逑

纤维素酶,表面层,纤维素,外切葡聚糖酶

而生物酶降解法恰恰弥补了这个严重的弊端，从而得到了越来越多的应用。逡逑纤维素酶复合物包括内切葡聚糖酶（ＥＧ），外切葡聚糖酶（纤维二糖水解酶Ｉ和ＩＩ）逡逑和（３－葡糖苷酶（图３），各个纤维素酶组分彼此相互协调高效发挥作用以降解纤维素。逡逑纤维素酶可分为三大类酶：外切葡聚糖酶、内切纤维素酶和Ｐ－葡糖苷酶。外切葡聚糖酶逡逑可分为两类：Ｉ型酶从葡萄糖链的还原端进行攻击，而ＩＩ型从葡萄糖链的非还原端攻击，逡逑均产生纤维二糖；再经Ｐ－葡糖苷酶水解为单糖（Ｂａｒｒ邋ｅ／ｄ，１９９６）。内切纤维素酶与葡逡逑萄糖链无规则结合，并水解一个／几个糖苷键。逡逑．逦逡逑Ｇ－邋＿邋Ｇ邋－邋－－邋Ｇ－逡逑ＲＧ—Ｇ—－Ｇ—－Ｇ—Ｇ＊＊ｉｒＱｆｃＧ－：－Ｇ—Ｇ—Ｇ…Ｇ——Ｇ—ｉＧ—Ｇ—Ｇ—Ｇ逦ｍｄ逡逑（３—Ｇ—Ｇ—Ｇ＿－ｒ’＿Ｇ—■—Ｇ逦—Ｇ＾—Ｇ－＊￣Ｇ—＊Ｇ＊＊￣Ｇ逦—Ｇ逡逑（７—－ｆｊ—Ｑ——（３—逡逑＇邋Ｊ：气：％逡逑＇０邋Ｇ逡逑Ｈｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ邋＾一ＣＢＨ邋Ｉ逦ＣＢＨ邋ＩＩ逦ｆ３－ｇｌｕｃｏｓｉｄｉｉｓｅ逡逑Ｃａｔａｌｙｔｉｃ邋Ｄｏｍａｉｎ逦Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ邋Ｂｉｎｄｉｎｇ邋Ｍｏｄｕｌｅ邋一邋＼邋Ｌｉｎｋｅｒ逡逑Ｃｉ邋Ｇｌｕｃｏｓｅ逦Ｋ邋Ｒｅｄｕｃｉｎｇ邋Ｅｎｄ逦ＮＲ邋Ｎｏｎ－Ｒｅｄｕｃｉｎｇ邋Ｅｎｄ逡逑图３．各种纤维素酶在纤维素表面层上的作用逡逑３逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2;S514

【参考文献】