马铃薯花青素合成相关基因的克隆及分析

发布时间：2020-04-12 06:43

【摘要】：花青素是植物体内重要次生代谢产物,植物生长发育过程及响应生物或非生物胁迫中有着重要作用。本研究通过设计花青素合成途径中结构基因(PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、F3’H、F3’5’H、DFR、ANS和UF3GT)和调节基因(AN1)的特异性引物,从国外2号(SWS2)和闽薯一号(M1)叶片中筛选出差异表达基因F3H和DFR进行克隆及功能分析,并且通过对调节基因AN1的克隆及功能分析,解析马铃薯花青素合成的分子机理。并分析其在马铃薯不同品种不同组织中的表达及花青素含量,为解析马铃薯花青素合成机理奠定基础。主要结果如下:1、用半定量PCR从SWS2和M1叶中筛选出差异表达基因F3H、DFR、F3’5’H、ANS、UFGT。用qRT-PCR分析结构基因在不同品种不同组织的表达,结果显示:结构基因在SWS2各组织(根、茎、叶、匍匐茎、薯皮、薯肉)中的表达均高于M1各组织的,且结构基因在不同组织均有表达差异。SWS2和M1各组织(根、茎、叶、匍匐茎、薯皮、薯肉)的花青素含量结果显示:SWS2各组织的明显高于M1各组织,并且两品种中花青素含量从低到高依次为根、匍匐茎、茎、叶、薯肉、薯皮。2、通过同源克隆技术,从SWS2和M1中克隆了StF3H基因,两品种间的基因序列一样,CDS为1077bp,编码358个氨基酸。StF3H基因的蛋白由α-螺旋,β-折叠,延伸主链和无规则卷曲,且无规则卷曲为主,β-折叠最少。系统进化分析表明与野生马铃薯,番茄的亲缘关系比较近,跟圆叶葡萄和烟草的亲缘关系比较远。通过序列表明StF3H基因与烟草、灯盏草、乔木猕猴桃、番茄的序列相似性比较高,分别达到89%、91%、92%、97%。qRT-PCR分析显示,StF3H基因在匍匐茎中表达量最高,在根中的表达量最低,表达量由低到高分别为:根、薯肉、薯皮、叶、茎、匍匐茎。利用Gateway技术将获得表达载体pJAM1502-StF3H。通过农杆菌介导的转化烟草获得转StF3H基因的烟草阳性苗48株。3、通过同源克隆技术,从SWS2和M1中克隆了StDFR基因,两品种间的基因序列一样,CDS为1149bp,编码382个氨基酸。StDFR基因的蛋白由α-螺旋,β-折叠,延伸主链和无规则卷曲,且无规则卷曲为主,β-折叠最少。系统进化分析表明与辣椒、番茄的亲缘关系最近,与矮牵牛、烟草等蛋白的亲缘关系最远。通过序列表明StDFR与矮牵牛、茄子、杜鹃、番茄的蛋白序列相似性比较高,分别达到89%、92%、93%、97%。qRT-PCR分析显示,StDFR基因在匍匐茎中表达量最高,在叶中的表达量最低,表达量由低到高分别为:根、薯肉、薯皮、叶、茎、匍匐茎。利用Gateway技术将获得表达载体pJAM1502-StDFR。通过农杆菌介导的转化烟草获得转StDFR基因的烟草阳性苗25株。4、通过同源克隆技术,从SWS2和M1中克隆了StAN1基因,两品种间的基因序列一样,该基因CDS为774 bp,编码了258个氨基酸。系统进化树分析发现,StAN1与辣椒、茄子、芦竹的亲缘关系最近,与矮牵牛、苹果等的亲缘关系最远。qRT-PCR分析显示,StAN1基因在两品种中的表达量呈现一致,薯皮中的表达量最高,根中的表达量最低,其表达量从低到高依次为根、茎叶、匍匐茎、薯肉、薯皮。农杆菌介导转化烟草及马铃薯发现,转入StAN1基因的烟草,其整个植株颜色由绿色变成紫色,转基因马铃薯愈伤组织变紫。转StAN1基因的烟草花青素含量为20 mg/L FW,野生型烟草中的花青素含量为2 mg/L FW,该结果表明StAN1基因与花青素的合成有关。
【图文】：

电泳图,结构基因,马铃薯,电泳

MW (分子量) =摩尔质量 449.2 g/mol；DF 为稀释因子；103是将单位 g 换算为 mg；ε 为消光系数= 26 900 L × mol-1× cm-1；l = 比色杯厚度，cm。2.4 结果与分析2.4.1 SWS2 和 M1 中差异基因的获取提取马铃薯 SWS2 和 M1 叶片的 RNA,反转为 CDNA,以其为模板扩增结构基因，电泳图如下所示（图 2.1）。合成马铃薯花青素的结构基因 PAL、C4H、4Cl、CHS、CHI、F3’H 在 SWS2 和 M1 叶中表达水平无明显的差异，F3H、DFR、F3’5’H、ANS、UFGT 的表达有明显的差异。表达有差异的基因都是花青素合成后期的几个关键酶，并且有条带的粗细及颜色的深浅可以看出 SWS2 中的表达量明显高于M1 中的。

结构基因,匍匐茎,中薯

图 2.2 结构基因在 SWS2 和 M1 各组织的表达Fig. 2.2 Expression of structural genes in SWS2 and M12.4.3 SWS2 和 M1 各组织花青素含量测定的分析SWS2 和 M1 的各组织（根、茎、叶、匍匐茎，，薯皮、薯肉）进行花青素含量的测定，发现在薯皮和薯肉中两者的花青素含量都是最高的（图 2.3）。SWS2中，薯皮中花青素的含量最高达到 0.3 mg/L ,根最低含有 0.067mg/L，从低到高依次为根、匍匐茎、茎、叶、薯肉、薯皮。M1 中薯皮中花青素含量最高为 0.06 mg/L,根中花青素含量最低为 0.017 mg/L，从低到高依次为根、匍匐茎、茎、叶、薯肉、薯皮。0.150.20.250.30.35（g/mL）WFSWS2
【学位授予单位】：青海大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S532

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