水稻APSK活性调控机理分析

发布时间：2020-04-22 06:27

【摘要】：硫是植物生长发育必需的营养元素。在自然界中,硫同化的代谢形式因物种而异。在植物中,转运至胞质的硫酸盐可被胞内ATP硫酸化酶催化为腺苷-5'-磷酸(APS),APS可被还原形成亚硫酸盐,也可在腺苷-5'-磷酰硫酸激酶(APSK)的催化下转化为3'-磷酸腺苷5'-磷酰硫酸(PAPS),提供硫酸基团供体以修饰各种代谢物。APSK在植物中与APS还原酶共同竞争硫同化途径的一级和二级分支之间的硫酸盐,其对植物的正常发育至关重要。尽管植物中硫酸化合物对植物发育有重要作用,且硫酸盐的转运与代谢机制研究成熟,但对于提供激活硫酸盐供体PAPS的酶APSK 了解甚少。在拟南芥中鉴定了四种的APSK。根据APSK在拟南芥中的定位和功能,发现APSK1和APSK 2在硫酸化代谢物的合成中起主要作用。APSK1主要调节硫的初级和次级代谢过程,并且受到氧化胁迫的APSK1在C86和C119之间形成二硫键会降低其催化活性。通过对APSK序列进行分析,发现水稻APSK1含有与拟南芥APSK C86和C1 19同源的半胱氨酸。我们实验室先前的研究已经表明氧化应激反应能够明显减少野生型水稻APSK1的活性,而C36A和C69A的双重突变能够缓解这种氧化作用。水稻APSK的序列和三维模拟结构分析显示C77,C168,C212也易被氧化,而且很可能也在其活性调节中起作用。本研究中,我们利用水稻APSK1基因作为模板,分别构建了 C77A,C168A和C212A的突变体。用原核表达的突变体在还原和氧化环境下进行动力学分析。结果表明,在DTT存在下,C77A,C168A和C212A的kcat分别降低到21.3%,9.1%和9.9%,Km分别降低到野生型酶的2.6%,12.2%和20.2%,Kiaps被发现显着增加。在氧化条件下,C77A,C168A和C212A的kcat分别下降到野生型的36.2%,22.6%和38.2%,Km降低到1.8%,6.1%和5.9%,Kiaps上升到野生型的328%,745%和655%。说明除C36和C69在其活性调控中发挥重要作用外,C77A,C168A和C212A还可能涉及活性调节,特别是在氧化条件下。进一步的结构分析可能提供更多的见解很多酶在高温条件下就会失去活性,但绝大部分的嗜热酶在此环境中仍能保持较高的催化活性,因此嗜热酶的研究和开发也是目前市场上的热点,嗜热菌就是当前获得嗜热酶最直接和可靠的来源。硫酸盐在次级代谢转化途径中形成分支点,一些致病细菌如结核分枝杆菌主要通过APS还原酶将APS还原成亚硫酸盐,提供了将硫合成各种代谢物的主要途径。相比之下,其他细菌,真菌和人类依次使用APSK和APS还原酶在初级硫同化途径中将APS转化为PAPS,然后通过PAPS还原酶进一步代谢生成亚硫酸盐。在实验室的前期工作中,我们发现苍白空气芽孢杆菌为中度嗜热菌(Aeribacilluspallidus,最适生长温度为50℃),可以分泌抑菌活性物质,并且我们已经完成其基因组测序工作(未发表结果)。在本研究中,我们克隆并表达了苍白空气芽孢杆菌的APSK基因,并对其进行了酶动力学分析。实验数据结果表明嗜热菌APSK的最适pH为8.0,这与水稻、拟南芥等植物APSK的最适pH类似;嗜热菌APSK的最适反应温度为25℃,有意思的是在嗜热菌(A.pallidus JH-7)的最适生长温度50℃时APSK的活性较低,这说明在最适生长条件下此酶活性在较大程度上受到温度的影响。本次的实验数据测得嗜热菌APSK的KmAPS、KcatAPS分别为10.25 μM/L和62.87/s,远远大于拟南芥及水稻APSK的KmAPS和KcatAPS值,但是其催化效率Vm/Km(s-1·μM-1)相差并不大。APSK功能上的保守性说明APSK活性在嗜热菌生长发育过程中同样发挥重要的功能。
【图文】：

植物细胞,硫酸盐,硫酸化反应,磷酰

还原形成亚硫酸和Ｓ２－［１７’邋１８］，最后整合成半胱氨酸；也可在腺苷－５＇－磷酰硫酸激酶逡逑（ＡＰＳＫ）的催化下生成３邋Ｉ－磷酸－腺苷５邋磷酰硫酸（ＰＡＰＳ），ＰＡＰＳ作为硫酸化反应逡逑的硫供体参与调节化合物的生理功能及蛋白间的互作（图１）［１９］。硫代葡萄糖苷是逡逑多种植物的次生代谢物，因其合成过程中的硫酸化反应需要ＰＡＰＳ作为供体，所以逡逑突变ＡＰＳＫ会导致硫代葡萄糖苷合成量降低Ｗ２１］。作为硫还原途径主要产物之一逡逑的谷胱甘肽，在细胞内具有多种功能；参与维持胞内的氧化还原平衡及细胞的解毒逡逑及螯合重金属过程。并且ＡＰＳＫ及ＡＰＳ还原酶（ＡＰＳＲ）的活性比例直接影响到还原逡逑谷胱甘肽的合成，这在很大程度上也影响着植物的抗病、抗逆性能［１７＿邋２２］。逡逑硫是所有活生物体的必需元素，是生物合成多种代谢物和大分子所必需的。逡逑硫元素经细胞膜上的硫转运蛋白转运进入植物细胞，以硫酸盐的形式运输和储逡逑３逡逑

水稻APSK活性调控机理分析

APSK突理
【学位授予单位】：浙江师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S511

【参考文献】