苦荞类黄酮糖基转移酶的重组表达与酶学性质研究

发布时间：2020-05-01 11:09

【摘要】：黄酮类化合物是具有2-苯基色原酮结构的一类植物次生代谢物,它常以糖苷的形式存在于植物体内,参与着诸多生命活动。尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶(UDP-glycosyltransferase,UGT)介导着黄酮类化合物的糖基化修饰过程,它能够将多种糖基(如葡萄糖,半乳糖,鼠李糖,阿拉伯糖等)从UDP-糖基供体转移到类黄酮糖苷配基上,改变黄酮类化合物的稳定性、可溶性及生物活性,参与植物的生长发育,次生代谢物累积及胁迫响应等过程。本研究拟克隆苦荞类黄酮糖基转移酶(UDP-glycose:flavonoid glycosyltransferase,UFGT)FtUFGT1,FtUFGT5,FtUFGT6,FtUFGT7基因,构建各FtUFGT的重组表达和纯化体系,并分析FtUFGT的酶学性质,以期为其体外催化黄酮类衍生物的合成奠定基础;此外,研究拟通过重组表达苦荞UDP-鼠李糖合酶(UDP-rhamnose synthase,RHM)解决糖基转移酶活性测定底物UDP-鼠李糖缺乏的问题;基于pCAMBIA3301-eGFP植物表达载体,实现苦荞类黄酮糖基转移酶在SR-1烟草(Nicotiana tabacum cv.Petit Havana SR-1)中的过表达,以期为深入研究FtUFGT对苦荞次生产物积累的调控及催化底物奠定材料基础。研究主要获得如下研究结果:(1)从本地苦荞转录组数据库筛选出4个苦荞类黄酮糖基转移酶基因FtUFGT1,FtUFGT5,FtUFGT6,FtUFGT7。多序列比对显示,所选FtUFGT与来自其他物种的UFGT一致性较高,预测FtUFGT1与为类黄酮O-糖基转移酶,FtUFGT6为UDP-鼠李糖:类黄酮3-O-葡萄糖苷(1→6)鼠李糖基转移酶,FtUFGT7为类黄酮C-糖基转移酶。通过qRT-PCR分析了4个FtUFGT基因在苦荞各组织中的表达水平,结果表明,四种FtUFGT基因在苦荞各组织的表达模式差异明显,FtUFGT1,FtUFGT7在花中有最高表达量;FtUFGT5和FtUFGT6在种子中表达水平最高。4个基因在茎中表达水平均最低,预示四种酶在次生代谢途径中行使着不同的功能。(2)通过RT-PCR克隆目的基因,经无缝克隆构建了pGEX-6p-1-FtUFGT1,pGEX-6 p-1-FtUFGT5,pGEX-6 p-1-FtUFGT6,pGEX-6 p-1-FtUFGT7表达载体,实现了4种目的蛋白在大肠杆菌Rosetta(DE3)中的可溶性表达,并通过GST亲和层析纯化得到高纯度目的蛋白。以槲皮素为底物,采用薄层色谱法及高效液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)法分析了重组FtUFGT1的酶学性质。结果表明FtUFGT1具有黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶活性,能够以UDP-葡萄糖(UDPG)和槲皮素为底物合成异槲皮素。FtUFGT1在30℃,pH7.0条件下可发挥最高活性,实现槲皮素向异槲皮素的高效转化,比活力为9.174U/mg。含有1μmol/L FtUFGT1的反应体系中,槲皮素和UDPG的浓度分别在1.526×10~3~2.287×10~3μmol/L和5.084×10~4~16.980×10~4μmol/L范围内时,酶活性与底物浓度呈良好线性关系。FtUFGT1的三突变体F21Y_F23Y_F127Y丧失了对槲皮素的糖基化活性。(3)构建苦荞UDP-鼠李糖合酶FtRHM的原核表达载体pMAL-c4x-FtRHM,实现了其在大肠杆菌中的可溶性表达,通过Amylose-Sepharose亲和柱纯化获得了目标蛋白。以UDPG为底物未检测到FtRHM的UDP-鼠李糖合成活性。(4)构建了四种FtUFGT的pCAMBIA3301-eGFP植物表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法侵染SR-1型烟草。通过Basta抗性筛选和PCR检测共获得77株过表达FtUFGT1烟草,36株过表达FtUFGT6烟草及2株过表达FtUFGT7烟草。分光光度法测定过表达FtUFGT1的T0代烟草中总黄酮含量显示,各株系总黄酮含量差异无明显规律。
【图文】：

图 1-1 几种类黄酮化合物骨架结构Fig.1-1 The structure of several flavonoids 黄酮类化合物的代谢物中黄酮类化合物代谢是 个繁复的过程，该途径由多基因参与并受到多调节。黄酮类化合物的合成始于苯丙素途径，这 过程中 L-苯丙氨酸生成oA，香豆酰 CoA 依次合成柚皮素，二氢山梨醇，，二氢槲皮素。二氢槲皮花青素合成通路参与花色素类物质的形成，也可以在黄酮醇合酶（Flave，FLS）的作用下转化为槲皮素，接着由 UFGT 糖基化修饰依次形成异槲（燕雪芬 2015）。有研究指出，多种转录因子通过影响类黄酮合成途径中相关基因的表达水性实现对植物中黄酮类化合物谱的调节。目前研究较多的相关转录因子如 M WD40，它们可以形成 MBW 复合物调控该途径（Imène et al. 2011）。但道 WD40 可以独立作用于与花青素合成相关的 DNA 靶序列（Don et al. 20

第 章 引言UGT 由相对较大的多基因家族编码（Gachon et al. 2005）。据统计，大约50%植物 UGT-1家族的蛋白质在N-末含有44个氨基酸的共有序列，即植物次生产物糖基转移酶（Plant secondary product glycosyltransferase motif,PSPG）基序，这 序列最先由 Jane 和 Monica Hughes（1994）在比对木薯的 8 个 cDNA 序列时发现，后来在其他植物的次生代谢相关 UDP-糖基转移酶中也证实了这 序列的存在。来自松叶菊中 UGT73A5 的三维模型显示 UDP-葡萄糖的尿嘧啶部分与这 基序中高度保守的 HCGWNS 残基直接进行相互作用（Hans et al. 2010），推测这 PSPG 基序参与酶与 UDP-糖的结合(Kim et al. 2013)。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S517

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本文编号：2646584