NtDXS和NtSPS在烟草茄尼醇生物合成中的功能研究

发布时间：2020-05-03 13:06

【摘要】：茄尼醇是植物体内重要的次生代谢产物,在植物生长发育过程中起着重要的调控作用。它是含有45个碳原子的反式长链聚异戊二烯,根据萜类的分类属于多萜的范畴。另外,由于其具有重要的药用价值及经济价值,对其研究较为广泛。本研究通过克隆烟草茄尼醇合成过程中的关键酶茄尼基焦磷酸合酶基因SPS,构建了pBI121-SPS和pBI121-DXS-SPS过表达载体,通过烟草遗传转化进行基因过表达植株茄尼醇含量分析,探讨茄尼醇的生物合成的调控机制。研究结果如下:(1)克隆烟草K326的SPS基因序列,大小为1206bp,同源性系统进化分析表明烟草K326 SPS属于SPS3基因家族,共编码401个氨基酸,不含信号肽,没有跨膜结构域,含有15个磷酸化位点,亚细胞定位在叶绿体,含有两个结合Mg~(2+)的保守结构域,是Isoprenoid_Biosyn_C1 superfamily的成员之一。SPS蛋白与绒毛烟草、林烟草和普通烟草高度一致,同源性达100%,与茄科其他物种辣椒、土豆、番茄等的SPS蛋白的一致性达到了95%以上,具有异戊烯基焦磷酸合酶典型的DDxxD的结构域,该蛋白具备异戊烯焦磷酸合酶的功能。(2)成功构建了pBI121-SPS表达载体和pBI121-DXS-SPS双基因共表达载体,获得了过表达SPS基因的转基因植株和过表达DXS和SPS双基因的转基因植株。通过荧光定量PCR和高效液相色谱对DXS基因和SPS基因与茄尼醇的含量进行分析,苗期过表达SPS基因的植株中,SPS基因表达量最高提升了3.25倍,DXS基因表达量最高提升了9.3倍,茄尼醇的含量最高提升了3倍左右;过表达DXS和SPS基因的植株,苗期DXS基因表达量和SPS基因表达量最高分别是对照的10.2倍和5.3倍,茄尼醇的含量是对照的2-2.5倍。为提高烟草生物合成茄尼醇提供了有效的方法,对烟草天然活性成分的综合开发利用研究,具有重要的理论意义及较高的经济价值。(3)利用发根农杆菌C58C1、ATCC15834和A4进行了烟草K326的发根培养高效菌株筛选研究,其中C58C1菌株SPS基因转化效率最高;成功获得了SPS基因的C58C1转化菌株,转化SPS基因的C58C1菌株浸染烟草外植体的生根率达到53.2%,在含0.01mg/L NAA+50mg/L SM+50mg/L Rif+50mg/L Kana的MS固体培养基毛状根生长良好,为建立烟草发根培养体系生物合成茄尼醇奠定了良好的实验基础。
【图文】：

甘油醛-3-磷酸为原料，在关键酶 1-脱氧木糖-5-磷酸合酶和 1-脱氧木糖原酶的作用下生成 IPP。第二个步骤是直接前体的生成阶段，包括r{牛酸（GPP）、法尼基二磷酸（FPP）、r{牛儿基r{牛儿基二磷酸（GGPP），在这个阶段，有三个关键酶，分别是r{牛儿基二磷酸合酶（GPPS）、磷酸合酶（FPS）和r{牛儿基r{牛儿基二磷酸合酶（GGPPS）（图 1-2 。第三个步骤则是对前体物质的修饰，包括环化、氧化还原、酰化、糖基化等。目前，前两个步骤已经研究的比较清楚，并且，所有的萜类化合都需要经过这些步骤。而第三个步骤则是在植物的次生代谢中决定了萜结构和功能的多样性。目前，在已知的报道中，植物中合成萜类化合物氧木酮糖-5-磷酸途径(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphatepathway，DXP)或醇 4-磷酸途径(methylerythritol 4-phosphate pathway，MEP)和甲羟戊酸valonic acid pathway，MVA)两种途径组成。大部分的高等植物基本上P 途径，并且和 MVA 途径具有协同效应[30]。有研究表明，MVA 途径主质中，但是，DXP 途径则主要是在叶绿体[31]。两条途径所产生的 IPP分会共用，，但是绝大多数都是在各自的途径中继续反应。

图 1-2 萜类合成的第二阶段和第三阶段Figure1-2：The second stage and the third phase of terpenes synthesis1.1.1.2 萜类化合物的其他反应1）氧化反应不同的氧化剂在不同的条件下，可以将萜类成分中各种基团氧化，生成各种不同的氧化产物。常用的氧化剂有臭氧、铬酐（三氧化铬）、四醋酸铅、高锰酸钾和二氧化硒等，其中以臭氧的应用最为广泛。四醋酸铅也是氧化双键的试剂，曾广泛应用在萜类成分的化学研究工作中[32]。2）脱氢反应脱氢反应可认为是氧化反应的一种，为研究萜类特别是环萜类成分化学结构中一种很有价值的反应。环萜的碳架经过脱氢转变为芳香烃类衍生物。脱氢反应通常在惰性气体的保护下，用铂黑或者钯做催化剂，将萜类成分与硫或硒在惰性气流中加热(200℃～300℃)，环萜的碳架则因脱氢转变为芳香烃类衍生物，有时复杂的环可能裂解，有时也可能有环合反应同时存在[32]。3）加成反应萜类成分中的双键多能与氢卤酸类如氢碘酸或氯化氢在冰乙酸溶液中反应，
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S572

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本文编号：2647573