水稻多效性QTL Ghd6的克隆和功能研究

发布时间：2020-05-03 16:33

【摘要】：水稻开花期是指从播种到始穗所经历的天数,是影响水稻地区适应性、季节适应性和产量的重要因素之一。本研究在特青(TQ)导入珍汕97(ZS)的导入系BC_4F_2代中定位了一个调控开花期、株高和产量的多效性QTL,Ghd6,它在长、短日照条件下都促进抽穗,对光周期不敏感。我们通过图位克隆策略分离了Ghd6,并对Ghd6的分子功能进行了探索。本研究的主要结果如下:1.Hd1是Ghd6的候选基因:在BC_4F_2群体中,开花期、株高和每穗颖花数共分离,呈现3:1的单基因分离比。含有TQ等位型的Ghd6植株NIL-TQ相比ZS等位型的植株NIL-ZS抽穗延迟、株高和每穗颖花数增加。借助3300株Ghd6的BC_4F_2群体,选择极端晚抽穗、株高较高的576个单株筛选重组单株。把Ghd6定位在标记Ghd6-12和S56标记区间,该区间包含开花期调控关键基因Hd1。比较测序发现,TQ等位型Hd1在CCT保守结构域缺失了4 bp,造成了移码突变。所以Hd1是Ghd6的候选基因。2.Hd1/Ghd6转基因功能验证:构建ProHd1:Hd1:GFP载体转化NIL-TQ,T_1共分离检测和T_2代表型考察表明,转基因阳性植株比阴性植株开花期显著提前、株高和每穗颖花数显著降低,并且恢复到ZS的水平。同时敲除ZS的Hd1,T_1代突变植株表现出了晚抽穗表型,并且与NIL-TQ开花期一致。因此,Hd1就是多效性QTL Ghd6。3.Hd1在长日照条件下功能转换:对NIL-ZS和NIL-TQ进行了长、短日照处理,发现NIL-ZS在长、短日照条件下均抽穗提前、株高降低、每穗颖花数减少和产量降低。表明在ZS背景下,Hd1在长、短日照条件下均促进抽穗,对光周期不敏感。Real-time PCR分析表明,Hd1在长、短日照下通过上调Ehd1、Hd3a和RFT1的表达量来促进抽穗。之前的研究认为Hd1在长日照条件下抑制抽穗,而在短日照下促进抽穗,表现出强烈的光周期敏感性。因此,Hd1在长日条件下表现出双向调控开花的功能,我们称之为Hd1功能转换。4.Hd1的功能转换依赖于Ghd7:发现Hd1在ZS背景下长、短日照均促进抽穗。而在明恢63(MH)背景下Hd1在长日照条件下抑制Ehd1、Hd3a和RFT1的表达,延迟抽穗;而在短日照条件下上调Ehd1、Hd3a和RFT1的表达,促进抽穗。分析ZS和MH背景下的Ghd7和Hd1两基因近等基因系不同组合的开花期,表明Ghd7决定Hd1在长日照条件下的功能转换。5.Ghd7.1和Ghd8调控Hd1功能转换:比较Ghd7、Ghd8和Hd1三基因近等基因系开花期,发现Ghd8可以强烈地增强Ghd7对Hd1的功能转换。比较Ghd7、Ghd7.1和Hd1三基因在MH和ZS背景下不同组合的开花期,发现在MH背景下Ghd7和Ghd7.1互作促使了Hd1的功能转换,而在ZS背景下Ghd7.1加强了Ghd7促使Hd1功能转换的能力。分析在ZS背景下Ghd7.1和Ghd8有功能而Hd1分离的近等基因系,发现Ghd7.1Ghd8也可以促使Hd1功能转换。6.Ghd7、Ghd8、Ghd7.1和Hd1不同组合光周期敏感性具有差异:对Ghd7、Ghd8、Ghd7.1和Hd1不同组合近等基因系进行长、短日照处理,Ghd7Ghd8Hd1对光周期最为敏感,Ghd7Ghd7.1Hd1、Ghd7Hd1、Ghd8Hd1、Ghd7.1Hd1和Ghd7Ghd7.1具有较强的光周期敏感性,单独的Ghd7.1在ZS背景中对光周期较为敏感而在MH背景中敏感性较弱,单独的Ghd7、Ghd8和Hd1以及四基因均无功能的光周期敏感性微弱甚至不敏感。7.Ghd7、Ghd8和Hd1之间的蛋白互作:Ghd7的CCT结构域能够结合Hd1的锌指结构域(32-111aa)以及锌指与CCT之间的区域(112-337aa)。通过Ghd8的酵母筛库实验发现,Ghd8可以和OsHAP5A、OsHAP5B、OsHAP5D、OsHAP5E和OsHAP5O互作,酵母点对点验证了这一结果,并且发现Ghd8还和OsHAP5T互作。同时也进行了Ghd7、Hd1和OsHAP5家族蛋白的酵母互作验证,发现Hd1和OsHAP5A、OsHAP5B、OsHAP5D以及OsHAP5E互作,Ghd7和OsHAP5A、OsHAP5D及OsHAP5E微弱互作。8.Hd1具有转录激活活性:Hd1在原生质体中的转录激活活性检测表明Hd1具有转录激活活性,而且这种转录激活活性来自于锌指与CCT之间的区域(112-337aa),但是CCT结构域的突变会严重破坏这种激活活性。通过向Hd1转录激活活性检测体系引入Ghd7蛋白,发现Ghd7可以抑制Hd1的转录激活活性,但并不能转换该活性为转录抑制活性。9.Ghd7和Hd1显著增加Ghd8在全基因组的结合能力:获得ZS背景下ProGhd8:Ghd8:GFP和Ghd7、Hd1不同组合的转基因材料,其开花期表型基本和近等基因系一致。对Ghd7-Ghd8:GFP-Hd1材料进行免疫沉淀质谱联用(IP-MS),发现Ghd8可以和OsHAP5C互作。随后对一系列的ProGhd8:Ghd8:GFP转基因材料进行染色质免疫共沉淀测序技术(ChIP-seq)分析,解析了Ghd8的全基因结合位点,发现Ghd7和Hd1显著增加了Ghd8结合DNA的范围,可能Ghd7和Hd1与Ghd8的蛋白互作加强了其相应复合体结合DNA的能力。
【图文】：

图 1 Ghd6 的 BC4F2分离群体长日照条件下的开花期、株高和每穗颖花数的次数分布和表型。A、B 和 C，NIL-ZS（左）和 NIL-TQ（右）在不同时期的植株和穗子；D、E 和 F，Ghd6 的开花期、株高和每穗颖花数的频数分布；G、H 和 I，Ghd6 的开花期、株高和每穗颖花数的表型； Ghd6-ZS 、 H 和 GhdTQ ， Ghd6 位点为纯合 ZS 等位型的植株、杂合等位型的植株和纯合 TQ 等位型的植株； ** ，t 测验 p 值小于 0.01。

Ghd6-TQ 的 Hd1 编码区进行测序，TQ 和 Ghd6-TQ 等位型相对于 ZS 和 Ghd6-ZS 等位型的 Hd1 在保守的 CCT 结构域区段+1089 位点缺失了 4bp（AAAG）（图 2B），，造成了移码突变（图 2C）。因此我们认为 Hd1 是 Ghd6 的候选基因, TQ 等位型 CCT结构域的 4bp 缺失可能造成了 Hd1 功能缺失。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S511

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本文编号：2647805