马铃薯StSUT基因的表达分析及StSUT2基因表达载体的构建

发布时间：2020-05-03 17:11

【摘要】：马铃薯(Solanum tuberosum L.)是世界上继小麦、水稻、玉米之后的第四大粮食作物,栽培范围遍布全球160多个国家。植物蔗糖转运蛋白(sucrose transporter,SUT)主要负责蔗糖从“源”器官到“库”器官的长距离运输,影响植物的生长和发育,决定作物的产量和品质。在马铃薯中共分离到三种SUT基因,分别为StSUT1、StSUT2和StSUT4,近期研究表明StSUT1和StSUT4影响马铃薯植株的生长、块茎的产量和光周期调控基因的表达,而StSUT2的生理功能仍不清楚,对其表达模式和亚细胞定位等方面还缺乏深入的研究。本研究分析了三种StSUT在马铃薯不同组织器官中的表达模式,并构建了SUT2植物超表达载体和原核表达载体,主要得到以下实验结果:(1)采用qPCR技术,对马铃薯“Favorita”和“Shepody”两个品种的SUT基因在不同组织器官、不同光照时间中的相对表达量进行了分析,结果表明:两个马铃薯品种的表达模式类似,StSUT1基因主要在成熟的叶片和老叶中表达,并且受光照时间的影响。StSUT4基因主要在花和老叶中表达,在茎、根以及匍匐茎中也有较高的表达,也受光照时间的影响。StSUT2基因主要在花和老叶中表达,在成熟叶片、茎、根以及匍匐茎中也有较高的表达,但是受光照时间影响不大。各个组织器官中StSUT基因的相对表达量在4 h时几乎均高于16 h时,但也有些例外,这些现象推测可能与马铃薯的块茎形成有关。(2)从马铃薯“Atlantic”品种的组培苗叶片中提取总RNA,以其反转录获得的cDNA为模板,PCR扩增得到了StSUT2基因,并通过TOPO定向克隆构建了入门载体pENTR-StSUT2,经PCR和序列分析鉴定,该片段大小为1818 bp,编码605个氨基酸残基,通过序列分析与文献报道的碱基序列有98%的同源性;通过Gateway技术中的LR重组反应,构建了pGWB2-StSUT2植物超表达载体,并转入农杆菌GV3101中。(3)以马铃薯”Atlantic”品种的cDNA为模板,克隆了StSUT2基因,与pET-21d载体连接,转化BL21(DE3)大肠杆菌,得到了pET-StSUT2原核表达载体。以上研究对后续探究马铃薯StSUT2的功能奠定了基础。
【图文】：

系统进化树

3图 1.1 SUTs 系统进化树Fig1.1 Phylogenetic tree of SUTs引自 Sauer 等[8]，略有修改AbSUT1 (Asarina barclaiana;AAF04294),AgSUT3 (Apium graveolens;ABB89051),AmSUT1 (Alomeridionalis; AAF04295),AtSUC1 (At1g71880),AtSUC2 (At1g22710),AtSUC3 (At2g02860),AtS(At1g09960),AtSUC5 (At1g71890),AtSUC6 (At5g43610),AtSUC7 (At1g66570),AtSUC8 (At2g14AtSUC9 (At5g06170), BoSUC1 (Brassica oleracea;AAL58071), BoSUC2 (B. oleracea;AAL5807BoSUT1 (Bambusa oldhamii; AAY43226), CsSUT2 (Citrus sinensis;AAM29153), DgSUT4 (Datiglomerata; CAG70682), DcSUT1 (Daucus carota; BAA89458), EeSUCx (Euphorbia esula;AAF657EuSUT2 (Eucommia ulmoides; AAX49396), HbSUT2a (Hevea brasiliensis; ABJ51934), HbSUT2bbrasiliensis; ABJ51932), HbSUT5 (H. brasiliensis; ABK60189), HvSUT1 (Hordeum vulgare; CAB75HvSUT2 (H. vulgare; CAB75881), JrSUT1 (Juglans regia;AAU11810), LeSUT2 (Lycopersicum

克隆技术

马铃薯 StSUT 基因的表达分析及 StSUT2 基因表达载体的构建BP 反应：利用传统的酶切连接的克隆方法将目的基因导人“入门克隆”。LR 反应：在 BP 反应中后，将入门载体与合适的表达载体进行 LR 反应重组，最终的“表达克隆”。传统的酶切连接方法构建载体步骤繁琐，效率低，花费时间长，而 Gateway 技以快速高效的完成载体的构建。Gateway 技术具有多方面的的利用价值，利用 Gateway 技术构建载体已成功应许多领域，Zhu 等曾改造 Gateway 技术中的载体，用来研究真菌中的高通量表达[64]；B等曾构建了基于 Gateway 技术的目标载体，，用来在大肠杆菌中做高通量克隆和表达[65]。由此可见，Gateway 技术在分子生物学领域中具有重要的意义。
【学位授予单位】：兰州理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S532

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