棉花R2R3-MYB基因家族海陆种间序列变异及与纤维性状的相关性分析

发布时间：2020-05-03 18:05

【摘要】：棉花作为重要的经济作物,是纺织工业的原材料。棉纤维是由胚珠外珠被表皮细胞发育分化而成的一种不分叉单细胞,是研究细胞伸长的强大模型系统。随着更先进的纺织技术被纺织工业引入,其对棉花产量和纤维品质提出了更高的要求。目前,我国主要的棉花的栽培种包括2个二倍体棉种,亚洲棉(G.arboreum L.)和草棉(G.herbaceum L.)以及2个异源四倍体棉种,陆地棉(G.hirsutum L.)和海岛棉(G.barbadense L.)。棉花纤维长度和产量是棉纤维两个重要指标。2个异源四倍体栽培种中,陆地棉具有产量高的特性,但纤维品质中等;海岛棉纤维品质优良,且具有抗病等优异性状,但是产量较低。为解决棉花产量和纤维品质的同步改良,育种家和遗传学家通过种间杂交的方法构建高世代回交重组自交系(Interspecific Backcross Inbred,BIL)和染色体片段代换系(Chromosome Segment Substitution Line,CSSL)来对棉花纤维品质和产量进行遗传改。R2R3-MYB基因家族作为棉纤维发育过程中的优势基因家族,其家族多个成员参与到了纤维发育的不同阶段。然而,这些基因的遗传变异是否直接影响棉花纤维品质和产量,棉花种质中是否存在这类基因的优良等位变异,它们是否能直接应用于棉花纤维品质和产量的遗传改良等问题还有待研究。本研究通过对R2R3-MYB基因家族在已经完成基因组测序的陆地棉(AD1)和海岛棉(AD2)及他们的2个二倍体祖先种雷蒙德氏棉(G.raimondii,D5)和亚洲棉(G.arboreum,A2)中进行了全基因组比较分析;利用纤维性状QTL(quantitative trait locus)热点区域(hotspots)与R2R3-MYB基因家族成员进行共定位,筛选纤维发育相关候选基因;对具有海陆遗传变异的候选基因在海陆为亲本的BIL群体中与纤维性状进行相关性分析,挖掘优良等位变异,并对其进行功能验证,主要结果如下:1.利用陆地棉(AD1)和海岛棉(AD2)及其2个二倍体祖先种雷蒙德氏棉(D5)和亚洲棉(A2)的基因组数据预测棉花中的R2R3-MYB基因家族成员。在这4个棉种中,本研究共鉴定到1228个R2R3-MYB基因,其中216个来自雷蒙德氏棉D5基因组,213个来自于亚洲棉A2基因组,406个来自于陆地棉AD1基因组,393个来自于海岛棉AD2基因组。对四个棉种的R2R3-MYB基因家族成员进行系统发育分析和密码子替换率分布分析,发现棉花在从两个二倍体祖先种进化至两个异源四倍体种的过程中,R2R3-MYB基因家族发生了7种特异的基因复制和缺失事件模型;同时该家族成员在2个四倍体棉种中的2个亚基因组(At和Dt)中存在不均衡进化。2.本研究首次利用全基因组共定位的方法在海陆种间群体内去阐明R2R3-MYB基因家族成员海陆之间序列多样性和纤维品质及产量等自然变异之间的遗传学关系。结果显示,86个R2R3-MYB基因能够与纤维品质和产量的QTL hotspots发生共定位,其中包括42个R2R3-MYB基因共定位在纤维长度的QTL hotspots;将20个种间SNP(single nucleotide polymorphism)开发成分子标记在两个不同海陆亲本的高世代回交重组自交系(backcross inbred lines,BILs)中进行相关性分析。共得到11个候选基因内存在的SNP位点与纤维品质具有极显著的相关性,表明这些基因种间的序列多样性与纤维品质性状的自然变异具有相关性;除此之外,我们发现5对海陆等位基因的功能SNP位点与这些基因的在纤维发育过程中的表达模式存在一定的相关性。3.利用全基因组染色体共定位的方法,本研究筛选到一个与纤维发育相关的候选基因GhMYB5_A12。该基因与一个纤维性状QTL-cluster发生共定位,该QTL-cluster内包含一个纤维长度Hotspot,FL_QTL_Hotspots_A12,该结果在遗传学角度上说明了该基因在纤维发育过程中有可能发挥着比较重要的作用。表达模式分析结果显示,该基因在纤维中优势表达,其他组织中几乎不表达。另外GhMYB5_A12在海岛棉和陆地棉纤维发育过程中转录水平存在差异,且海陆等位基因存在一个种间SNP位点。对该SNP位点在陆地棉SG 747与海岛棉Giza 75为亲本的BC_2F_6群体中进行基因分型。相关性分析结果显示,海岛棉的该位点与4个环境的纤维长度呈显著或极显著正相关,与3个环境的强度呈显著正相关,同时与3个环境的衣分呈显著正相关,结果表明来自于海岛棉MYB5的等位基因能够改善纤维的长度、强度和衣分。4.在拟南芥中过表达GhMYB5_A12,对T_3代拟南芥株系的种子进行观察,发现GhMYB5_A12能够促进拟南芥表皮毛的产生,并且有的表皮毛出现分叉的现象。3个T_3代转基因株系的种皮毛出现概率分别为8.52%,8.24%和7.08%。以陆地棉中24(CRI24)为受体,将该基因的过表达载体转入棉花中。发现,2个T_3代过表达株系中0 DPA纤维细胞突起数目明显增多,同时成熟纤维的长度、强度及衣分也显著增加。以上结果说明该基因在棉花的纤维的起始和伸长过程中都发挥着比较重要的作用。利用VIGS技术得到两组GhMYB5_A12 VIGS植株(G 1和G 2),发现在0 DPA时,VIGS植株纤维突起细胞均明显减少,另外成熟纤维的衣分明显降低。5.本研究利用0,3和7 DPA胚珠和纤维的混合cDNA文库作为诱饵库对GhMYB5_A12进行文库筛选,得到101个阳性克隆,其中包括8个已经被证明与纤维发育相关的蛋白。为了明确海陆等位基因种间SNP位点对其在纤维发育调控网络中的功能的影响,本研究分析了MYB5海陆两种基因型与纤维发育相关蛋白(GhHOX3、GhEGL3、Gh14-3-3、GhRDL、GhHD1以及GhEXPA)的相互作用。结果显示,GhMYB5_A12和GbMYB5_A12同时都和GhEGL3及GhHOX3发生互作,为MYB5参与纤维发育调控网络提供了证据,而且证明了海陆序列变异对其蛋白的结合能力没有影响。
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西北农林科技大学博士学位论文时在生产实践中，棉纤维也是重要的工业原材料和最广泛的天然纤维材料，解析其生长发育的分子机理，对于旨在于提高纤维产量和品质开展的分子育种及棉花产业均具有重要意义。棉纤维发育过程可分为互相重叠的四个时期：纤维起始阶段（initiation），纤维伸长阶段（elongation），次生壁合阶段（secondary cell wall synthesis，SCW）成及成熟阶段（maturation）（图 1-1）(Ramsey and Berlin, 1976a, b)。棉纤维的四个不同发育阶段都对棉花的品质和产量有一定的影响 (Ramsey and Berlin, 1976a, b)。纤维细胞起始分化和伸长期影响着每个胚珠上纤维的数量及长度。伸长和次生壁增厚期则影响着纤维的强度和马克隆值。棉花纤维发育的前三个时期，，伴随着许多重要生理生化过程，同时大量的基因也对这三个时期发挥着重要的调控作用。目前对棉花纤维发育的分子调控机理的研究主要主要集中在关键转录因子、植物激素、表观遗传调控和信号分子这 4 方面（图 1-2）(Wang et al., 2019a)。

第一章 文献综述外，低浓度的油菜素内酯（brassinosteroid，BR）能显著促进棉纤维细胞的 合成抑制则抑制纤维细胞的发育 (Sun et al., 2005)。另一个证明 BR 参与纤维例子是，研究者发现棉花细胞色素 P450 基因（PAG1）突变体，pag1，纤维型相比显著缩短的同时表现出叶片黑绿和植株矮小等BR缺失的典型表型 (Y2014)。通过体外实验，研究者还提出了植物激素与超长链脂肪酸通过级联反维细胞的发育，如图 1-4 所示 (Qin et al., 2007)。目前关于超长链脂肪酸对育的影响刚刚起步，脂肪酸代谢相关基因参与纤维伸长的分子机制研究也只水平，所以，该领域有待进一步研究。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S562

【参考文献】

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本文编号：2647908