基于人参全基因组的多组学数据解析人参皂苷生物合成

发布时间：2020-05-12 06:23

【摘要】：人参是名贵中药,人参皂苷是人参的主要活性物质。由于人参基因组大而复杂,目前有关其遗传背景仍所知甚少。人参遗传信息的缺乏,已经严重影响人参产业的发展。人参皂苷的积累和分布发生在特定组织,但有关分子机制的研究较少。本研究基于本草基因组学研究策略,应用二代测序技术首次组装完成人参全基因组序列;利用质谱成像技术定位人参皂苷空间分布,结合转录组学和蛋白质组学技术全面解析了人参根部组织层面分子表达模式,旨在通过关联人参皂苷分布和分子差异表达筛选潜在人参皂苷合成关键基因,阐述人参皂苷生物合成途径及其调控机制。主要发现和结果如下:1.人参全基因组测序解析人参生物遗传背景利用二代测序技术对人参进行全基因组测序,组装得到3.41Gb的人参基因组图谱。人参基因组含有62%以上的重复序列,编码42,006个基因,包括488个细胞色素P450基因;2,556个转录因子和3,745个转运蛋白,这些注释基因可能是与次生代谢相关的重要基因。注释到31个人参皂苷合成保守途径(甲羟戊酸,MVA)及33个互补途径(磷酸甲基赤藓糖醇,DXR/MEP)相关酶基因,且多个酶基因存在多拷贝现象。我们推测,MVA/MEP途径中存在的多种异构体,有助于三萜化合物生物合成的灵活生产或调控。此外,共鉴定了 225个UDP-糖基转移酶(UGT),这些UGTs也是人参基因组中最大基因家族之一。基因组结构信息和进化分析表明,串联重复有助于UGTs的扩增和分化。人参基因组在其进化过程中富集了大量的UGT家族,这种富集与人参皂苷的多样性有关。这些结果促进了人参基因组研究,加深了对三萜化合物生物合成的理解。2.人参代谢组检测揭示人参皂苷的空间分布基于DESI-MS获得了人参根部横切面人参皂苷的空间分布图像,发现人参皂苷Rg1/Rf显著富集在根部的周皮和内部中柱中;Re,Rb1,Rs1/Rs2,Ra1/Ra2和假人参皂甙Rc1主要分布在外围周皮中,而根中心分布较少或含量极低;Ra3和Rd在整个横切面均有分布。随后,采用高效液相色谱技术(HPLC)对经剥离后的人参根三部分组织中的8种人参皂苷进行定量,发现Rg1,Re,Rf,Rg2,Rb1,Rc,Rb2和Rd均在周皮中含量最高,且显著高于皮部和中柱(P0.001)。其中Rg1,Re,Rf和Rb1在周皮中显著富集与质谱成像结果一致。这些研究再次表明人参根部人参皂苷分布不均一,推测次生代谢物不均匀分布与植物的防御机制及人参皂苷生物合成基因的表达差异有关,为进一步分子水平转录和翻译分析提供依据。3.人参转录组测序揭示人参根组织层面基因表达模式人参根组织层面转录组测序,检测到32,144个表达基因,共表达基因占56.4%,组织特异性表达基因为659～797个,提示人参根组织层面基因转录的一致性和差异性。发现超过2.1万个表达基因与人参皂苷的含量正相关,说明人参皂苷生物合成和调控的复杂性。组织间两两比较基因表达模式,筛选得到2,116个差异表达基因,主要参与代谢过程、细胞过程、单有机体过程、定位、响应刺激、生物学调控;作用于细胞、细胞膜及细胞器;主要行使催化活性、结合及转运蛋白活性。人参皂苷生物合成途径中,三个组织中均有高表达的基因,如HMGR,PMK,IDI,SS,DDS和CAS在周皮中高表达,HMGS,MVD,FPS,SS,SE,OAS和PPT 在皮部中高表达,HMGR和SE在中柱中高表达,表明同一组织中不同基因在人参皂苷合成过程中的表达与调控的协同性和一致性,同时反映了同一基因家族的不同拷贝在时间和空间上的差异表达模式。三个拷贝的HMGR、两个拷贝的FPS、两个拷贝的DDS及60个UGTs在周皮中高表达,可能与多个人参皂苷在周皮中积累量较高有关。另外,19个人参皂苷合成相关基因发生差异可变剪接,表明可变剪接事件在人参皂苷生物合成途径中起重要的调控作用。本研究所获得转录组数据有效地增强了对人参皂苷生物合成途径的解析。4.人参蛋白质组检测揭示人参根组织层面蛋白表达模式采用Lable-free技术探索人参根部组织层面蛋白表达模式,检出2,719个蛋白。共表达蛋白占83.3%,组织特异性表达蛋白为172～500个,周皮中特异性表达蛋白最多,提示人参根组织层面蛋白表达的一致性和差异性。组织间两两比较蛋白表达模式,筛选得到839个差异表达蛋白,主要与结合、催化活性、结构分子活性、转运蛋白活性、抗氧化活性等有关,参与植物体内包括核糖体、氨基酸生物合成、碳代谢、淀粉和糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、糖酵解或糖质新生等代谢途径。相比皮部和中柱,90%的抗性相关蛋白在周皮中高表达,其中22个蛋白较皮部和中柱显著上调表达,反映了周皮作为保护组织行使防御作用的分子机制。此外,共鉴定到28个与人参皂苷合成相关蛋白,包括MVA途径中9个酶,MEP途径中7个酶及12个UGTs,这些酶在三个组织中的差异表达可能与其人参皂苷的合成及分布不均有关。本研究从整体蛋白质水平上探索人参根部代谢物不均匀分布的分子机制,筛选出与人参皂苷合成相关的差异蛋白,并对转录组研究结果进行验证和补充。5.转录组学和蛋白质组学联合分析通过联合分析发现RNA-seq和Lable-free数据间呈弱相关性。三个比较组中,差异表达趋势一致的分别有62个,98个和18个,这些基因多数在周皮中上调表达,主要与生物过程中的代谢过程、单-有机体过程、细胞过程、响应刺激等及分子功能中的催化活性、结合等有关,且其中参与代谢途径的基因数最多,提示这些分子对人参根的生长发育发挥重要的调节作用。超过88%的分子在mRNA水平差异表达,但在本试验中未检出蛋白表达,包括31个与人参皂苷合成相关的基因。在蛋白水平表达差异而mRNA水平无差异的分子中,99%以上检测出转录表达,包括7个与人参皂苷合成相关的酶,提示一些分子可能受到翻译后调控或运输的影响。本文绘制了人参基因组图谱,并对人参根组织层面的分子表达模式进行了全面研究,为进一步人参研究提供了强大的基因资源,将有助于改善对人参皂苷生物合成、积累和运输的复杂机制的理解。
【图文】：

深度分布,基因组序列,人参,深度分布

Table1.2 Statistical analysis of the P. ginseng draft genome. Size(bp) NumberContigN90 4,516 150,620N80 8,639 103,388N70 12,833 75,040N50 21,977 39,481Longest 574,183 -Total size 2,999,700,459 337,439ScaffoldN90 24,143 33,423N80 45,718 23,391N70 65,171 17,168N50 108,708 9,072Longest 1,303,414 -Total size 3,414,349,854 83,074Gap ratio 12.15%*-

维恩图,基因功能,数据库,基因

基因组蛋白预测 ab initio 和同源比对，应用 MAKER Pipline 从人参基因 42,006 个蛋白质编码基因模型，其中 88%的基因可从 R到。利用不同的数据库对人参基因功能进行注释，超过 9ank 非冗余数据库中注释得到（E- value = 1e-5），，Gene O注释的基因占 73.47％，利用 Kyoto Encyclopedia of G（KEGG）注释共有 68.39％的基因参与细胞生化过程（释基因中，包括可能与次生代谢相关的重要基因：如 4880 基因（包括 PPD-人参皂甙合酶（PPDS）CYP716A47，酶（PPTS）CYP716A53，以及齐墩果酸合酶 CYP716A52子和 3,745 个转运蛋白（图 1.3 和 1.4）。
【学位授予单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S567.51;Q943.2

【参考文献】