玉米ZmSTK1互作蛋白的鉴定及BiFC系统的初步建立
发布时间：2020-05-22 12:54
【摘要】：玉米作为全世界总产量最高的农作物,是重要的粮食作物和饲料作物,对于如何生产出高质量和高产量的玉米是目前的热点问题,而花粉的发育和传播是影响玉米产量和质量的重要因素。ZmSTK1是一种在玉米花粉中特异性表达的胞质类受体蛋白激酶,推测其在花粉发育和花粉管伸长过程中起作用,而蛋白质在生物体内行使功能并不是孤立的,需要与其他蛋白质共同协作。因此,探寻ZmSTK1的相互作用蛋白质,对于研究花粉发育和花粉管伸长具有重要意义。1、对玉米、水稻和拟南芥中RLCK IX亚家族基因的内含子/外显子结构进行生物信息学分析,发现大部分RLCK IX亚家族基因的内含子数量是相似的,在进化关系越近的基因之间的内含子位置和相位越相似,由此可知,整个亚家族基因的内含子数量和相位都是较为保守的。2、ZmSTK1含有16个丝氨酸、5个苏氨酸和2个酪氨酸磷酸化位点。普通胁迫结构域中包含1个丝氨酸和1个苏氨酸磷酸化位点,激酶域中包含2个丝氨酸磷酸化位点,不含有苏氨酸磷酸化位点。ZmSTK1激酶域中的Ser527较为保守,具有出现频率高,以及突变频率低的特点,对ZmSTK1的功能具有重要作用。3、本试验首先选择了5个候选蛋白ENO1、HSP1、EF1-A、EF1B和S28,并成功克隆到ZmSTK1、ENO1、HSP1、EF1-A、EF1B和S28基因的目的片段,构建ZmSTK1-pGBKT7载体和5个候选蛋白与pGADT7载体。4、通过酵母双杂交法鉴定ZmSTK1相互作用蛋白质。首先进行ZmSTK1的细胞毒性和自激活检测,结果显示ZmSTK1对AH109酵母菌株不具有细胞毒性,单独将ZmSTK1-pGBKT7载体转化到AH109酵母菌株中也不会激活下游报告基因的转录活性。随后,将ZmSTK1-pGBKT7载体与每个候选蛋白载体一对一分别共转化到AH109酵母菌株中,结果显示ZmSTK1与ENO1存在相互作用关系,而ZmSTK1与HSP1、EF1-A、EF1B和S28不存在相互作用关系。5、成功构建了ZmSTK1-p-SPYCE(M)载体,可以为后续的BiFC法鉴定ZmSTK1相互作用蛋白质奠定基础。
【图文】：
14图 2-1 玉米、水稻和拟南芥 RLCK IX 亚族基因进化树及基因结构图Fig.2-1 The map of phylogenetic and gene structure for RLCK IX subfamily in maize, rice and Arabidopsis注：图中左侧为玉米、水稻和拟南芥 RLCK IX 亚族基因的系统进化树，其中红色标记的 GRMZM2G165433 为 ZmSTK1的基因号。图右侧为每个基因对应的内含子-外显子结构及内含子相位信息。Note: The left side of the figure is a phylogenetic tree of the RLCK IX subfamily genes for maize, rice, and Arabidopsis.Thered labeled GRMZM2G165433 is the ZmSTK1 gene number. The right side of the figure shows the intron-exon structure andintron phase information for each gene.
图 2-2 ZmSTK1 蛋白一级结构分析Fig.2-2 The primary structure analysis of ZmSTK1注：图 a 为横坐标为常见的 20 种氨基酸的单字母缩写，纵坐标为氨基酸的数量。图 b 为 C-score 代表剪切位点值，通常在剪切位点处，氨基酸 C-score 最高；S-score 代表信号肽分数，在信号肽区域 S-score 最高；Y-score 是 C-score和 S-score 综合分值，，若存在多个剪切位点时，就取 S-score 高的位点为剪切位点；S-mean 代表 N-末端氨基酸残基到剪切位点处所有氨基酸残基的 S-score 平均值；D-score 为 S-score 和 Y-score 的平均值，是用来判断是否为分泌蛋白的指标。在理想情况下，对于非分泌蛋白质，SignalP 输出结果中所有分值都应该非常低，接近-0.1。Note: Figure a. The abscissa indicates the common single-letter abbreviation of 20 amino acids, and the ordinate indicates thenumber of amino acids. Figure b. C-score represents the value of the cleavage site.Usually, the C-score is the highest at thecleavage site; S-score represents the signal peptide value. S-score is the highest in the signal peptide region; Y-score isC-score and S-score composite scores.If there are multiple cleavage sites in the amino acids sequence, the highest S-score siteis regared as the cleavage site; S-mean represents the S-score averages of the N-terminal amino acid residue to the cleavagesite for all amino acid residues; D-score is an average value of S-mean and Y-score and is used as an index for determiningwhether it is a secreted protein. Ideally, for non-secreted proteins, all points in the SignalP output should be very low,
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S513
本文编号：2676028
【图文】：
14图 2-1 玉米、水稻和拟南芥 RLCK IX 亚族基因进化树及基因结构图Fig.2-1 The map of phylogenetic and gene structure for RLCK IX subfamily in maize, rice and Arabidopsis注：图中左侧为玉米、水稻和拟南芥 RLCK IX 亚族基因的系统进化树，其中红色标记的 GRMZM2G165433 为 ZmSTK1的基因号。图右侧为每个基因对应的内含子-外显子结构及内含子相位信息。Note: The left side of the figure is a phylogenetic tree of the RLCK IX subfamily genes for maize, rice, and Arabidopsis.Thered labeled GRMZM2G165433 is the ZmSTK1 gene number. The right side of the figure shows the intron-exon structure andintron phase information for each gene.
图 2-2 ZmSTK1 蛋白一级结构分析Fig.2-2 The primary structure analysis of ZmSTK1注：图 a 为横坐标为常见的 20 种氨基酸的单字母缩写，纵坐标为氨基酸的数量。图 b 为 C-score 代表剪切位点值，通常在剪切位点处，氨基酸 C-score 最高；S-score 代表信号肽分数，在信号肽区域 S-score 最高；Y-score 是 C-score和 S-score 综合分值，，若存在多个剪切位点时，就取 S-score 高的位点为剪切位点；S-mean 代表 N-末端氨基酸残基到剪切位点处所有氨基酸残基的 S-score 平均值；D-score 为 S-score 和 Y-score 的平均值，是用来判断是否为分泌蛋白的指标。在理想情况下，对于非分泌蛋白质，SignalP 输出结果中所有分值都应该非常低，接近-0.1。Note: Figure a. The abscissa indicates the common single-letter abbreviation of 20 amino acids, and the ordinate indicates thenumber of amino acids. Figure b. C-score represents the value of the cleavage site.Usually, the C-score is the highest at thecleavage site; S-score represents the signal peptide value. S-score is the highest in the signal peptide region; Y-score isC-score and S-score composite scores.If there are multiple cleavage sites in the amino acids sequence, the highest S-score siteis regared as the cleavage site; S-mean represents the S-score averages of the N-terminal amino acid residue to the cleavagesite for all amino acid residues; D-score is an average value of S-mean and Y-score and is used as an index for determiningwhether it is a secreted protein. Ideally, for non-secreted proteins, all points in the SignalP output should be very low,
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S513
【参考文献】
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1 崔红军;魏玉清;;酵母双杂交系统及其应用研究进展[J];安徽农业科学;2015年13期
2 沈瑶瑶;严庆丰;;蛋白质相互作用研究进展[J];生命科学;2013年03期
3 朱昀;王猛;贾志伟;练云;金颖;王国英;;一种从富含多糖的玉米幼穗中提取RNA的方法[J];植物学通报;2007年05期
本文编号：2676028
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