亲环素和钙离子信号在花生盐胁迫响应中的功能研究

发布时间：2020-05-24 16:54

【摘要】：花生(Arachis hypogasa)是我国重要的油料作物。随着土壤盐渍化的加剧,我国可利用耕作面积不断减少,而为了不与粮争地,在盐碱地种植花生已成为一个新的农业发展趋势。由于盐渍土中的盐胁迫通常会对植物造成离子毒害、渗透压失衡以及氧化损伤,这对花生的高产和品质产生了很大的威胁。根系是植物最先感受盐胁迫的部位,花生萌发期根系发育是否良好直接影响花生后期的生长与产量。因此,研究花生萌发期根系的耐盐机制,对于花生在盐渍土中的种植有重要的参考意义。植物亲环素(Cyclophilin)属于一类多基因的高度保守的蛋白家族,具有肽基脯氨酰顺反异构酶活性。大量研究表明,亲环素在多种植物响应高盐、干旱、热、冷、强光等非生物胁迫中发挥重要作用,但目前为止,还没有关于花生亲环素AhCYP在耐盐方面的研究。本研究以“花育22”花生萌发期根系为材料,获得AhCYP的全长序列,构建过表达载体,利用农杆菌介导的方法将AhCYP转入野生型烟草,并对转基因烟草的耐盐性进行评价。此外,本研究通过对150 mM NaCl胁迫下的花生萌发期根系施以5 mM EGTA、0.05 mM CPZ以及2 mM LaCl3来研究钙离子信号在花生萌发期根系盐胁迫响应中的作用。主要结果如下:1.花生亲环素AhCYP在盐胁迫下的功能研究从“花育22”的cDNA中扩增出AhCYP的基因序列,该基因的开放阅读框长519 bp,能编码172个氨基酸。AhCYP属于亲水性蛋白,无信号肽,不存在跨膜结构域,含有17个磷酸化位点,其二级结构主要以无规则卷曲与α螺旋为主。此外,AhCYP启动子的调控区域包含有与激素响应、光响应、参与植物逆境和防御基因激活等相关的元件。进化分析发现,AhCYP与棉花GhCYP1的亲缘关系较近。亚细胞定位研究证实AhCYP定位于细胞质中。利用qRT-PCR的方法对胁迫下的花生萌发期根系中的AhCYP的表达模式进行分析,结果发现AhCYP在盐胁迫下被诱导上调表达,在3 h时表达量最高;jAhCYP在渗透胁迫、氧化胁迫初期先上调表达,随后呈现下调表达。由以上结果表明,AhCYP对于不同的非生物胁迫的响应机制存在差异。对转AhCYP烟草进行分析发现,在正常生长条件下,转基因烟草植株生长发育良好、结籽多。表型实验表明,转AhCYP烟草对NaCl、Mannitol、MV表现出抗性。盐胁迫下,转AhCYP烟草的萌发率、根系活力、渗透调节物质含量以及SOD、CAT等抗氧化酶活性显著高于野生型,而相对电导率、MDA含量以及ROS的积累则显著低于野生型烟草。由以上结果表明,过表达AhCYP能提高转基因烟草的耐盐性。2.钙离子信号在花生萌发期根系盐胁迫响应中的功能研究盐胁迫对花生萌发期根系的抑制作用主要表现在抑制主根伸长和侧根生长、降低根系活力、增加ROS的积累、加重膜脂过氧化以及降低抗氧化酶的活性等方面。而在盐处理后施加钙信号抑制剂,花生萌发期根系呈短细状并出现褐化。与单独盐胁迫相比,花生萌发期根系中的抗氧化酶活性降低,造成根系中ROS的过量积累,引起根系细胞膜的氧化损伤。钙信号抑制剂抑制抗氧化酶活性,从侧面反映出钙信号通路可能通过调节抗氧化酶的活性在植物盐胁迫响应中发挥作用。钙信号抑制剂抑制了AhCaM、AhCBL1、AhCDPK、AhCNGC15的表达。同时,对与盐胁迫相关的AhNHX3、AhNHX8、AhCYP、AhARF2、AhARF9等的表达也起抑制作用,进而推测钙信号通路可能通过调控胁迫相关基因的表达来响应盐胁迫。此外,钙信号抑制剂抑制盐胁迫下ABA合成相关基因AhAO1、AhABA2、AhNCED1的表达,阻碍了ABA的生物合成,影响了ABA依赖的信号通路在花生萌发期根系盐胁迫响应中的作用,而这暗示了钙信号通路可能与ABA信号通路共同调控花生萌发期根系对盐胁迫的响应。
【图文】：

有肽基脯氨酸顺反异构酶活性（ＰｐｉＢ），其结构域共有１５２个氨基酸组成。ＡｈＣＹＰ逡逑也是亲环素型肽基脯氨酸顺反式异构酶（Ｐｍ－ｉｓｏｍｅｒａｓｅ），其结构域共有１６４个逡逑氨基酸组成（图２－２Ａ）。ＳＭＡＲＴ分析结果显示，ＡｈＣＹＰ具有Ｐｒｏ－ｉｓｏｍｅｒａｓｅ，逡逑与邋Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ邋Ｄｏｍａｉｎｓ邋分析结果一致（图邋２－２Ｂ）。逡逑Ａ逡逑９逦Ｕ逦？逦ＩＭ逦Ｕｌ逦ＩＭ逦ｉｎ逡逑？Ｋｉｒｉｃ邋ｈｉ＊ｉ逡逑ＰｐｌＢ逡逑Ｐｒｏ＿ｉａｏ？？ｒａＢ0逡逑＾ｉ，Ｕ逦叩０００６０逡逑３ｗ＊ｒｒ？？ｉｌｉｎ逦ｃｕｃｌｅｔｉｈｉＵｎ邋ｓｔ＾ｗｒｆａａｉｌｕ逡逑Ｂ逡逑？■Ｐｒｏｌｉｓｏｍｅｒａｓｅ邋｜逡逑０邋＇１００逡逑图２－２邋ＡｈＣＹＰ含有的保守蛋白结构域逡逑Ｆｉｇ．邋２－２邋Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ邋ｄｏｍａｉｎｓ邋ｉｎ邋ＡｈＣＹＰ逡逑２．２．１．３逦ＡｈＣＹＰ的理化性质分析逡逑利用ＰｒｏｔＰａｒａｍ对ＡｈＣＹＰ的一级结构的理化性质进行分析。结果显示，逡逑ＡｈＣＹＰ的相对分子质量为１８．４邋ｋＤａ，邋ｐｉ为７．７０，其理论半衰期为３０邋ｈ。因其不逡逑稳定性指数为１８．７５

ＡＡＧＧＴＴＧＧＧＴＣＣＡＧＣＴＣＴＧＧＣＡＧＯＡＣＧＴＣＧＡＡＧＣＣＡＧＩＧＣＴＣＧＴＣＧＣＴＧ大逡逑ＣＴＧＣＧＯＴＣＡＡＣＴＧＴＣＴＴＡＧ逡逑图２－１邋ＯＲＦｆｍｄｅｒ的分析结果逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ＯＲＦｆｉｎｄｅｒ逡逑２．２．１．２逦ＡｈＣＹＰ的结构域分析逡逑通过ＮＣＢＩ在线网站中的Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ邋Ｄｏｍａｉｎｓ对ＡｈＣＹＰ蛋白质保守结构域逡逑进行分析。结果发现，ＡｈＣＹＰ属于亲环素超家族（ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ邋ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ），具逡逑有肽基脯氨酸顺反异构酶活性（ＰｐｉＢ），其结构域共有１５２个氨基酸组成。ＡｈＣＹＰ逡逑也是亲环素型肽基脯氨酸顺反式异构酶（Ｐｍ－ｉｓｏｍｅｒａｓｅ），其结构域共有１６４个逡逑氨基酸组成（图２－２Ａ）。ＳＭＡＲＴ分析结果显示，，ＡｈＣＹＰ具有Ｐｒｏ－ｉｓｏｍｅｒａｓｅ，逡逑与邋Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ邋Ｄｏｍａｉｎｓ邋分析结果一致（图邋２－２Ｂ）。逡逑Ａ逡逑９逦Ｕ逦？逦ＩＭ逦Ｕｌ逦ＩＭ逦ｉｎ逡逑？Ｋｉｒｉｃ邋ｈｉ＊ｉ逡逑ＰｐｌＢ逡逑Ｐｒｏ＿ｉａｏ？？ｒａＢ0逡逑＾ｉ，Ｕ逦叩０００６０逡逑３ｗ＊ｒｒ？？ｉｌｉｎ逦ｃｕｃｌｅｔｉｈｉＵｎ邋ｓｔ＾ｗｒｆａａｉｌｕ逡逑Ｂ逡逑？■Ｐｒｏｌｉｓｏｍｅｒａｓｅ邋｜逡逑０邋＇１００逡逑图２－２邋ＡｈＣＹＰ含有的保守蛋白结构域逡逑Ｆｉｇ．邋２－２邋Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ邋ｄｏｍａｉｎｓ邋ｉｎ邋ＡｈＣＹＰ逡逑２．２．１．３逦ＡｈＣＹＰ的理化性质分析逡逑利用ＰｒｏｔＰａｒａｍ对ＡｈＣＹＰ的一级结构的理化性质进行分析。结果显示，逡逑ＡｈＣＹＰ的相对分子质量为１８．４邋ｋＤａ
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S565.2

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本文编号：2678700