白及液体悬浮培养体系的建立及次生代谢产物的测定

发布时间：2020-05-29 08:42

【摘要】：目的:1.分离和鉴定白及中的次生代谢产物。2.筛选白及液体悬浮培养细胞中的次生代谢产物,并建立测量次生代谢产物含量的方法。3.构建白及液体悬浮培养技术体系,并建立细胞生长量及次生代谢产物累积量的动态变化曲线。4.优化白及液体悬浮培养体系。方法:1.白及次生代谢产物的分离与鉴定:采用95%乙醇对白及块茎干粉进行回流提取,以溶液萃取法对粗提物进行萃取得到正丁醇萃取部位。利用多种硅胶柱色谱及半制备型高效液相对该部分中的次生代谢产物进行分离纯化,利用核磁共振等波谱技术进行化合物结构鉴定。2.建立运用高效液相色谱配置二极管阵列检测器(High performance liquid chromatography-diode array detector,HPLC-DAD)检测白及次生代谢产物含量的方法:以分离得到的次生代谢产物为标准品,筛选白及液体悬浮培养细胞中的次生代谢产物,并利用分析型高效液相色谱定量分析方法测定次生代谢产物的含量。3.白及液体悬浮培养细胞生长特性的研究:以白及种子为实验材料,通过诱导、继代得到疏松愈伤组织,以愈伤组织为外植体构建白及液体悬浮培养体系,并监测细胞的生长状态,绘制生长曲线,同时实时测量培养过程中次生代谢产物的积累和变化情况。4.响应面法优化白及细胞液体悬浮培养体系:在单因素实验的基础上,采用响应面法的博克斯-本肯设计(Box-Behnken design,BBD)实验设计方案,在非激素水平优化白及液体悬浮培养体系,使其次生代谢产物累积量达到最大值。结果:1.从白及块茎乙醇提取物的正丁醇萃取部分中分离得到20个次生代谢产物,其中包括一种新的化合物。其结构分别鉴定为2,2′,2′′,7,7′,7′′-hexahydroxy-4,4′,4′′-trimethoxy-[9,9′,9′′,10,10′,10′′]-hexahydro-1,8,1′,6′′-triphenanthrene(1)、gymnosideⅥ(2)、dactylorhin A(3)、militarine(4)、2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲(5)、2,7-二羟基-3,5-二甲氧基-9,10-二氢菲(6)、2,3,7-三羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲(7)、2,6-双(对羟苯基)-3',5-二甲氧基-3-羟基联苄(8)、3,3'-二羟基-2-对羟苯基-5-甲氧基联苄(9)、2,6-双(对羟苯基)-3,3'-二羟基-5-甲氧基联苄(10)、3,3'-二羟基-5-甲氧基联苄(11)、3,3'-二羟基-2-(4-羟苯基)-5-甲氧基联苄(12)、3-羟基-5-甲氧基联苄(13)、3-羟基-5,3′-二甲氧基联苄(14)、1-对羟苯基-2-羟基-4,7-二甲氧基菲(15)、4,7,4′,7′-四羟基-2,2'-二甲氧基-1,1'-联菲(16)、对羟基苯甲醛(17)、对羟基苯甲醇(18)、对羟基苄甲醚(19)、对羟基苄乙醚(20)。2.以上述从白及块茎中分离得到的20种次生代谢产物为标准品,从白及液体悬浮培养细胞中筛选得到4种次生代谢产物:对羟基苯甲醇(18)、dactylorhin A(3)、militarine(4)、coelonin(5)作为白及液体悬浮培养体系次生代谢产物检测的指标成分;利用HPLC-DAD检测其质量浓度与峰面积的关系并建立标准工作曲线,对其进行方法学考察,结果表明精密度实验、稳定性实验、重复性实验、加样回收实验的结果标准偏差均符合次生代谢产物衡量分析要求。3.选取继代培养2次约30天的嫩黄疏松型愈伤组织作为起始白及液体悬浮培养的外植体,进行白及细胞液体悬浮培养,并进行细胞生长曲线及次生代谢产物累积曲线的绘制,通过对白及液体悬浮培养细胞生长曲线的分析发现Logistic函数方程曲线与试验数据更为接近。同时对白及悬浮培养细胞中的次生代谢产物累积量的检测发现对羟基苯甲醇在接种培养后39d累积量可以达到最大值,dactylorhin A与militarine的累积量均在接种培养后24d达到最大,coelonin的累积量在接种培养后18d达到最大。4.响应面法分析发现,参数组合培养液体积为21.74 mL、初始愈伤组织添加量为0.92g、培养液中蔗糖浓度为28.77 g/L培养得到的白及悬浮培养细胞中对羟基苯甲醇的含量可以达到最大值0.7928 mg/g;参数组合培养液体积为40.13 mL、初始愈伤组织添加量为0.82g、培养液中蔗糖浓度为30.73 g/L培养得到的白及悬浮培养细胞中dactylorhin A的含量可以达到最大值7.7920 mg/g;参数组合培养液体积为38.35 mL、初始愈伤组织添加量为1.40g、培养液中蔗糖浓度为38.32 g/L培养得到的白及悬浮培养细胞中militarine的含量可以达到最大值9.4467 mg/g;参数组合培养液体积为39.87 mL、初始愈伤组织添加量为1.19g、培养液中蔗糖浓度为31.16 g/L培养得到的白及悬浮培养细胞中coelonin的含量可以达到最大值0.3451 mg/g。结论:本研究以白及种子为实验材料,成功建立起细胞液体培养体系,并以从白及中分离得到20种次生代谢产物为标准品,筛选得到白及液体悬浮培养细胞中的4种次生代谢产物,研究了白及细胞生长量与这4种次生代谢产物累积的关系,最后通过响应面法优化了白及液体悬浮培养的体系,得到了非激素水平各因素的最佳条件组合,成功获得了高次生代谢产物累积量的白及液体悬浮培养体系。
【图文】：

核磁共振,白及,次生代谢产物,块茎

提取物的正丁醇萃取部分中分离得到 20 个次生代谢产物, 经核磁共振等波谱技术进行化合物结构鉴定，其结构鉴定为2,2′,2′′,7,7′,7′′-hexahydroxy-4,4′,4′′-trimethoxy-[9,9′,9′′,10,10′,10′′]-hexahydro-1,8,1′6′′-triphenanthrene (1)、gymnoside Ⅵ (2)、dactylorhin A (3)、militarine (4)、2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲(5)、2,7-二羟基-3,5-二甲氧基-9,10-二氢菲(6)、2,3,7三羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲(7)、2,6-双(对羟苯基)-3',5-二甲氧基-3-羟基联苄(8)3,3'-二羟基-2-对羟苯基-5-甲氧基联苄(9)、2,6-双(对羟苯基)-3,3'-二羟基-5-甲氧基联苄(10)、3,3'-二羟基-5-甲氧基联苄(11)、3,3'-二羟基-2-(4-羟苯基)-5-甲氧基联苄(12)、3-羟基-5-甲氧基联苄(13)、3-羟基-5,3′-二甲氧基联苄(14)、1-对羟苯基-2羟基-4,7-二甲氧基菲(15)、4,7,4′,7′-四羟基-2,2'-二甲氧基-1,1'-联菲(16)、对羟基苯甲醛(17)、对羟基苯甲醇(18)、对羟基苄甲醚(19)、对羟基苄乙醚(20)。其中化合物 1 为新化合物，化合物 6、7、13、16、19 首次从白及属植物中分离得到，化合物 18、20 首次从白及中分离得到。白及中的次生代谢产物见图 1-1 和表 1-3。

化合物,信号,单元结构,学位论文

士学位论文位移 (C156.2, 157.2, 121.5 和 153.0), 以及 H-5′′、H-6′合，得出构成化合物 1 的 C 单元结构为：2′′,7′′-二羟基-6′′基团。通过分析 H-5′′与 C-1、H-3 与 C-1 和 H-10 与 C-1了 C 单元结构与 C-1 相连接。同时考虑到分子组成，，A C-8 和 C-1'直接连接。NOESY 谱进一步证实了位于 C氧基与 H-5、H-5'和 H-5′′的相关性。因此化合物 1 的结′-hexahydroxy-4,4′,4′′-trimethoxy-[9,9′,9′′,10,10′,10′′]-hexahyhrene。
【学位授予单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S567.239

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