人参中PgRFK与PgEXO70B1的表达分析及其功能的初步探究

发布时间：2020-06-05 03:33

【摘要】：人参(Panax ginseng C.A.Meyer)作为我国一味传统的中药材,吉林省的主要道地药材之一,已有悠久的利用历史。现代研究表明,作为人参活性物质之一的人参皂苷Rb_1具有调节神经系统、保护心血管系统、延缓衰老等药理活性,同时对肿瘤及糖尿病等疾病的治疗发挥着重要作用。人参生长周期长,皂苷产量较低,随着市场对人参相关产品的需求日益增加与现代生物技术的迅速发展,在分子水平深入挖掘人参皂苷Rb_1生物合成的关键基因资源,具有极其重要的理论与实践意义。本研究通过分析人参转录组数据库获得人参皂苷Rb_1生物合相关的基因群,命名为PgRb_1(A2),并对它们的表达模式进行分析。将PgRb_1(A2)与已获得功能验证的16个关键酶基因进行基因表达互作网络分析,发现PgRb_1(A2)与这些基因之间存在紧密的联系;同时,通过与人参皂苷Rb_1含量进行相关性分析,在PgRb_1(A2)基因群中进一步获得与人参皂苷Rb_1含量紧密相关的重要候选基因PgRb_1S05和PgRb_1S08。利用qRT-PCR技术分析茉莉酸甲酯诱导下PgRb_1S05和PgRb_1S08基因的表达量与人参皂苷含量的相关性,验证上述分析的准确性。进而通过基因克隆和DNA重组技术分离并验证PgRb_1S08基因的生物学功能,通过原核表达系统成功表达PgRb_1S05酶蛋白。所得的结果如下:1.通过对人参皂苷Rb_1合成相关PgRb_1(A2)基因群的进行表达分析,发现PgRb1(A2)基因群中各基因的表达与Rb_1含量呈显著相关,且分属与不同蛋白家族,具有各自的表达特性。2.通过将PgRb_1(A2)与已获得功能验证的16个关键酶基因进行基因表达互作网络分析,发现PgRb_1(A2)与16个关键酶基因之间存在紧密的联系,且随着Rb_1含量的增高,基因与基因间的联系愈加紧密,参与的基因数目越来越多,筛选出与Rb_1高含量组相关的重要候选基因PgRb_1S05与PgRb_1S08。3.茉莉酸甲酯诱导的人参发状根中的总皂苷与单体皂苷Rb_1均呈现了显著的升高,qPCR的检测表明,PgRb_1S05与PgRb_1S08在不同皂苷含量下的基因的表达规律与基于转录组数据库的分析结果一致。4.通过基因克隆技术分离得到PgRb_1S08基因的全长序列,其长度为1836bp,编码515个氨基酸,通过相关生物信息学预测分析,其编码的蛋白具有典型的胞泌复合体结构,与拟南芥中胞泌复合体EXO70B1蛋白亚基基因的同源性最高,拟南芥原生质体亚细胞定位表明该蛋白主要定位在胞质中,与预测的结果一致,通过农杆菌介导法,获得转基因拟南芥T_2代植株,且在该代拟南芥中表现出促进气孔打开的特性。5.通过3’RACE与PCR技术获得了PgRb_1S05的全长序列,其长度为1200bp,编码399个氨基酸,通过序列比对得出,该蛋白为人参中的核黄素激酶,为多功能蛋白,并成功的构建该基因的原核表达载体,通过Western鉴定该蛋白成功在大肠杆菌中表达,为该蛋白功能的深入研究奠定基础。
【图文】：

磷酸酯（FPP，Farnesene pyrophosphate），之后在鲨烯合酶[10]（SS）的作用下成角鲨烯（Squalene），并在鲨烯环氧酶（SE）[11]的作用下生成 2,3-氧化角鲨烯合成的第三阶段为 2,3-氧化角鲨烯在一系类酶的催化作用下生成不同人皂苷单体的过程，而在植物体中，2,3-氧化角鲨烯为萜类物质与甾醇类共同的体物质，其分别在羊毛甾醇合酶[12]（LAS）与环阿屯醇合酶（CAS）的作用下成羊毛甾醇（Lanotsterol）与环阿屯醇（Cycloartenol），这两个分支会生成固类（Sterols）物质。当 2,3-氧化角鲨烯在细树脂合酶（β-AS）[13]的作用下会生β 香树素（β-amyrim），其为齐墩果酸型五环三萜皂苷（例如:人参皂苷 R0）前体，当在达玛烷合酶（DDS）[14]的作用下生成达玛烯二醇（Dammarenediol然后该物质依次在，不同的单加氧酶细胞色素 P450[15]与糖基转移酶[16]（UGT

图 1-1 三萜类合成途径Fig.1-1 Triterpenoid synthesis pathway下，生成不同的人参皂苷单体（例如：人参皂苷 F11、Re、CK、Rb1）。达玛烷类型的人参皂苷分为原人参二醇（protopanaxadiol，PPD）和原人（protopanaxatriol，PPT）两类，二者的区别是在第 6 位上，原人参三醇一个取代位点。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S567.51

【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 杨昆;吕俊;张毅;赵永斌;张贺翠;韩叙;许军红;卢会翔;施松梅;;EXO70基因在甘蓝和白菜基因组中的倍增与趋异进化[J];科学通报;2015年24期

2 彭沛;宋志明;刘勇;郝宝顺;余舒杰;周彬;刘定辉;牛海名;熊肇军;朱洁明;吴伟康;钱孝贤;;人参皂苷Rb1抗小鼠脑自然衰老及其对mTOR/p70S6K通路的影响[J];中山大学学报(医学科学版);2015年02期

3 赵坤;吕孝敏;胡训霞;张萍;史春阳;王喜庆;葛才林;王泽港;;植物根系分泌蛋白研究进展[J];安徽农业科学;2015年06期

4 李蓉;钟益刚;钱康;;人参皂苷Rb1通过上调P53和P21抑制PDGF-BB诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞增殖[J];实用药物与临床;2014年12期

5 侯双利;韩梅;刘翠晶;林红梅;杨利民;;人参达玛烷二醇合成酶基因的克隆、序列特征和组织表达分析[J];吉林农业大学学报;2015年01期

6 尚文斌;郭超;赵娟;于希忠;张颢;;人参皂苷Rb_1通过上调脂肪组织葡萄糖转运体促进葡萄糖消耗[J];中国中药杂志;2014年22期

7 尚文斌;于希忠;王国强;赵娟;;人参皂苷Rb_1改善高脂喂养肥胖小鼠胰岛素抵抗和脂肪异位沉积[J];中国中药杂志;2013年23期

8 姚晓蒙;吴秋晗;安利国;尹苗;;胞外分泌复合体成员Exo70[J];生命的化学;2013年01期

9 陈士林;朱孝轩;李春芳;王勇;姚辉;孙超;宋经元;;中药基因组学与合成生物学[J];药学学报;2012年08期

10 蒋世翠;张明哲;王义;孙春玉;李校X;张美萍;;人参SQS基因的干扰载体构建及转化人参愈伤组织[J];吉林大学学报(理学版);2011年06期

相关博士学位论文 前4条

1 成妮妮;α-法尼烯合酶过表达对转基因烟草生长发育的影响及其基因启动子的克隆与功能分析[D];山东农业大学;2013年

2 应益昕;人参连作对土壤微生物群落的影响研究[D];北京协和医学院;2013年

3 邹赢锌;核黄素激酶对脑卒中发生的影响[D];第二军医大学;2011年

4 侯春喜;人参皂苷生物合成关键酶基因MVD和βAS的克隆及βAS的反义表达[D];吉林大学;2009年

相关硕士学位论文 前7条

1 李俐;吉林人参HD-Zip基因家族的系统分析及PgHB14-2基因转化番茄的研究[D];吉林农业大学;2017年

2 傅文W，

本文编号：2697438