枸杞14-3-3蛋白家族基因的克隆及功能解析

发布时间：2020-06-05 03:25

【摘要】：本论文在前期研究的基础上,从宁夏枸杞“宁杞1号”各个时期的混合花药中克隆了 3个14-3-3蛋白家族基因的cDNA,分别命名为Lb14-3-3a、Lb14-3-3b和Lb14-3-3c,并对这3个基因进行了生物信息学分析,时空表达、遗传转化和分子功能初步分析,具体研究结果如下:(1)采用RT-PCR技术,从“宁杞1号”花药中克隆了Lb14-3-3a、Lb14-3-3b和Lb14-3-3c基因的ORF,Lb14-3-3a基因的ORF长为768 bp,可编码255个氨基酸,分子量为61.9 kD,等电点为4.99;Lb14-3-3b基因的ORF长为747 bp,可编码248个氨基酸,分子量为63.09 kD,等电点为4.62;Lb14-3-3c基因OF长为777 bp,可编码258个氨基酸,分子量为64.14kD,等电点为4.95,它们都属于14-3-3蛋白超基因家族,且这3个蛋白质的二级结构主要由α-螺旋构成。(2)qRT-PCR分析表明,这三个枸杞花药蛋白家族基因在枸杞的不同组织、器官、不同花药发育时期都有表达,Lb14-3-3a基因在果实和花中优势表达,而在根茎叶中表达量相对较低,且在花药发育早期表达量相对较低,造孢细胞时期开始增加,到小孢子母细胞时期达到峰值,四分体时期开始下降,成熟花粉粒时期表达量最低;Lb14-3-3b基因在枸杞的花与果实中表达量较高,根、茎、叶中表达量较低,花药发育早期表达量相对较低,四分体时期开始增加,到二核花粉时期达到峰值;Lb14-3-3c基因在雄蕊中的表达量最高,在根、茎、叶,青果、红果、雌蕊、花瓣和花萼中的表达均较低,在小孢子母细胞时期表达量最高,成熟花粉粒时期表达量最低,推测该蛋白家族基因参与枸杞花器官生长发育的调控。(3)构建了植物过表达载体Lb14-3-3b-pC1305.1-35S和Lb14-3-3c-pC1305.1-35S。采用农杆菌介导途径将实验室前期构建的植物过表达载体pMDC83-Lb14-3-3a和Lb14-3-3b-pC1305.1-35S转入“三生烟”烟草中,结果表明,获得了 6株转Lb14-3-3a基因烟草植株,阳性转化率为54.5%,转Lb14-3-3烟草植株生长速度较快,有4株花器官出现畸变,出现喇叭型对称的6片花瓣,且柱头高于雄蕊,这与枸杞雄性不育突变体“宁杞5号”柱头和花药特征相一致;并获得9株阳性转Lb14-3-3b基因烟草植株,阳性转化率为75%,转基因烟草植株生长缓慢,有5株花器官出现畸变,出现花瓣缺失现象,有4片花瓣致使整个花型成四角型,缺少1个花丝,花药发育不完全,致使烟草植株难以完成正常的有性生殖,推测枸杞Lb14-3-3a和Lb14-3-3b基因可能影响了烟草植株的生长发育,在花粉的的败育过程中起着一定的调控作用。研究结果为深入探讨Lb14-3-3蛋白家族基因对枸杞花器官及枸杞植株生长发育的调控作用提供了理论参考,同时也为拓展Lb14-3-3蛋白在植物生长发育中的调控机制和分子机理提供了新思路。
【图文】：

被认为是祖先，协助细胞核组织完成基本功能，且ｓ组成员进化较早［１８＿１９］。逡逑一般情况下，１４－３－３蛋白形成了一个保守的真核家族．通过与多种靶点的磷酸化依赖性相互逡逑作用而发挥作用（图１－２），蛋白质磷酸化的丝氨酸残基在特定的基序成为１４－３－３蛋白结合的目标．逡逑通过与其中任一机制相互作用可导致目标蛋白的行为发生改变％］，磷酸化特异性地修饰蛋白后．逡逑可使蛋白发挥正常的功能，关于玉米早期和拟南芥0４ｒａ６／办花药发育的过程表明，磷逡逑酸化激酶、与染色质相关的蛋白质、磷酸酶与植物体内的１４－３－３蛋白质相互结合，在植物发育过逡逑程中起着重要的调控作用＾２２］。逡逑Ｐｒｏｔｅｉｎ邋Ｉ邋ｔ逡逑ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｊ邋｜邋Ｐｒ0ｔｅｉｎ邋ｋｉｎａｓｅ逡逑＞】夂）逡逑Ｃｈａｎｇｅ邋ｉｎ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ逡逑Ｃｈａｎｇｅ邋ｉｎ邋ｓｔａｂｉｌｉｔｙ逡逑Ｃｈａｎｇｅ邋ｉｎ邋ｓｕｂ－ｃｅｌｌｕｌａｒ邋ｌｏｃａｔｉｏｎ逡逑Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ邋ｗｉｔｈ邋ｏｔｈｅｒ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ逡逑图１－２邋１４－３－３蛋白的一般功能（引自Ｂｏｓｔｏｎ等，２００１）逡逑－２－逡逑

逦第一章引言逡逑胞核分裂的几率，致使ＢＲ途径参与调控植物细胞核的伸长和分裂（图１－４）。逡逑」逦＼邋ｔｅ’邋Ｌ逦一二逡逑＿＿＼邋｜邋—逦ｆ逦ｉ逡逑＇＇宁⑥逦！逡逑；？ＡＫｌｉ＾３＞逦ｔ邋＼逦／逡逑＿逦＿逦！－？，？＞＞逦逦Ｖ逡逑，邋／逡逑ｐｒｍａｓｏｍｅ＾邋、、邋ｎｕｃｌｅｕｓ＾邋ｘ邋＾逡逑ｐｂｓｍａ邋ｍｅｍｂｒａｎｅ逦ｃｙｔｏｓｏｌ逦逡逑图１－４邋１４－３－３蛋白在ＢＲ信号转导中的作用（引自Ｃｕｔｌｅｒ等，２０１０）逡逑脱落酸（ＡＢＡ）主要功能包括响应非生物胁迫、生物胁迫胁迫和种子发育，１４－３－３蛋白的表达逡逑己被证明受到ＡＢＡ的影响［３４］，，有研宄表明，在植物体内．ＡＢＡ反应元件被ｓｎｆｌ相关激酶２家族逡逑成员ＳｎＲＫ２蛋白激酶磷酸化，这些激酶由于ＡＢＡ信号传导而被激活，同时，这种磷酸化响应逡逑ＡＢＡ增加了邋ＡＢＦ３（ＡＢＦ３为１４－３－３蛋白的三个亚型）的稳定性，缺乏１４－３－３结合位点的突变型逡逑ＡＢＦ３则降低了这种效应［３５－３６］；钙依赖蛋白激酶（ＣＤＰＫｓ）是一种直接结合Ｃａ２＋
【学位授予单位】：宁夏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S567.19

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本文编号：2697428