耐冷候选基因OsRBCS3基因功能解析

发布时间：2020-06-05 03:00

【摘要】：中国是一个历史悠久的农业大国,水稻作为主要的粮食作物,解决了近14亿人口的温饱问题。低温冷害是一种常见的气象灾害,严重影响了稻作的生产,在东北地区尤其普遍,受到低温冷害的影响较为频繁,多为障碍性冷害,给水稻产量造成巨大损失。障碍性冷害每4-5年就会发生一次较严重的灾害,严重威胁水稻生产。为解决这一矛盾,就需要提高水稻品种的耐冷性。所以我们要克隆耐障碍性冷害基因并利用它培育耐冷品种。本研究前期通过水稻耐寒数字表达谱,筛选出一个与光合作用相关且在低温处理下表达量明显上调的基因,确定耐冷候选基因OsRBCS3为研究对象。本研究对这个基因的CDS区克隆以后,进行序列差异比对,发现L11和K131中二者CDS区没有差别,同时在低温胁迫下发现二者目的基因表达量明显不同,我们便认为该基因的表达量影响了两个品种的耐冷性。它超表达就耐冷。为了证明这个观点,一方面根据实验室现有的OsRBCS3基因过表达材料L-12、L-18品系,利用分子手段筛选其后代阳性株系,验证目的基因超表达以后是否提高了耐冷性;另一方面利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术创造K131中目的基因敲除的品系,验证目的基因沉默表达后耐冷性是否降低。如果假设成立,就说明这个基因表达量增加耐障碍性冷害能力就增加了。主要研究结果如下:1、确定了转基因苗期潮霉素筛选的筛选剂的最佳筛选浓度为15mg/L。利用该浓度筛选T_1代株系抗潮霉素的表型,共获得11个株系表型为抗性的幼苗,经过外源基因PCR鉴定,这11个株系中有60个单株为阳性结果,阳性得率为100%。其中材料L-12为6个,每个材料4~6株共33株,材料L-18为5个,每个材料4~6株共27株。2、取这11个株系的T_0代部分种子,用潮霉素抗性培养基筛选T_1代幼苗,不同株系对潮霉素抗性产生不同的分离比,其中,在T_1代中10个株系的分离比约为3:1,遵循孟德尔遗传模式。说明外源基因是单拷贝插入,且为单基因显性遗传。也有1株系的分离比低于3:1,不符合孟德尔遗传法则。3、收获这10个株系种子即T_2代,每个株系取部分幼苗进行hpt-PCR扩增,检测结果扩增出预期的目的片段大小为472bp,且全部为阳性。筛选出10个阳性过表达株系。分别是L-12为5个株系,L-18为5个株系。4、将OsRBCS3基因从耐冷水稻空育131中克隆出来,利用CRISPR/Cas9技术构建敲除载体,利用根瘤农杆菌介导法遗传转化空育131,获得阳性转基因株系CL为24株,通过分子检测和测序鉴定靶位点发生编辑的突变株系为18株,通过氨基酸序列比对发现,其中5/18株由于靶位点的修饰方式为碱基的插入而引发移码突变,提前产生终止密码子,翻译提前终止。5、对过表达材料和基因敲除材料分别进行进行孕穗期耐冷性指标鉴定,苗期耐冷性指标鉴定和real-time PCR检测,结果表明,利用Gataway技术获得的OsRBCS3基因超表达的转基因株系L-12和L-18的耐冷性和目的基因的表达量较野生型有明显的提高;相反,利用CRISPR/Cas9法编辑的耐冷OsRBCS3基因的突变体CL的耐冷性和目的基因的表达量较野生型有明显的下降。6、对过表达材料、基因敲除材料在低温冷害下进行生理指标的检测,结果显示:过表达植株在低温处理下Rubisco酶活性较野生型有所提高;敲除材料低温处理下Rubisco酶活性较野生型有明显下降。相反,在低温处理下丙二醛的含量,在过表达材料中MDA含量低于野生型材料,敲除材料MDA含量高于野生型材料。
【图文】：

2.1 试验材料2.1.1 水稻材料转基因受体材料：耐冷粳稻品种空育 131（K131）、冷敏感粳稻品种龙粳 1（L11），由黑龙江大学分子生物学重点实验室提供。转基因材料：L-12、L-18 和CL 品系由本研究培育创造的。2.1.2 供试菌株与载体菌株：EHA105 农杆菌，，由黑龙江大学生分子生物学重点实验室提供。DH5大肠杆菌（购自天根公司）。载体：过表达载体 pGWB12-R3、过表达载体 pGWB18-R3、水稻 OsRBCS3 因 CRISPR/Cas9 敲除载体 PVK-R3 是本研究构建。

OsRBCS1~OsRBCS5 上下游引物，并扩增与 OsRBCS3 基因的靶位点附近区域片段。OsRBCS1 基因引物 OsRBCS1-F/OsRBCS1-R（见表 2-1）能扩增出 912bp 的特异条带； OsRBCS2 基因引物 OsRBCS2-F/OsRBCS2-R（见表 2-1）能扩增出 680bp 的特异条带；OsRBCS4 基因引物 OsRBCS4-F/OsRBCS4-R（见表 2-1）能扩增出 659bp的特异条带；OsRBCS5 基因引物 OsRBCS5-F/OsRBCS5-R（见表 2-1）能扩增出681bp 的特异条带。OsRBCS3 基因家族间靶位点的序列比对发现，除 OsRBCS3基因外，家族间基因均有 4-14 个不等的碱基差异。
【学位授予单位】：黑龙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S511

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 肖友国;基因沉默[J];生物学教学;2002年12期

2 张新岩;朱颖;吴辉辉;郭红卫;;植物转录后水平基因沉默:调控基因表达的一把双刃剑[J];中国科学:生命科学;2016年06期

3 李保印;周秀梅;刘用生;;植物基因工程中转基因沉默研究进展[J];河南科技学院学报(自然科学版);2005年04期

4 朱莉,张春义,范云六;转基因植物中外源基因沉默机制的研究进展[J];生物化学与生物物理进展;1999年02期

5 高瑞;使基因沉默[J];飞碟探索;2001年06期

6 ;基因沉默临床研究获成功[J];临床合理用药杂志;2010年11期

7 董延龙;;转基因植物转录后的基因沉默[J];中国林副特产;2009年04期

8 吴蓓蕾;王锡锋;;植物病毒基因沉默抑制因子研究进展[J];植物保护;2007年02期

9 刘悦萍,赵晓萌,宫飞;转基因植物中外源基因沉默机制的研究进展[J];中国农学通报;2005年04期

10 燕安;让基因沉默的“小兵”——大显神通的小干扰RNA[J];百科知识;2005年14期

相关会议论文 前10条

1 陈爱葵;李梅红;;RNAi—基因沉默[A];遗传学进步与人口健康高峰论坛论文集[C];2007年

2 袁诚;李萃;马金;韩成贵;于嘉林;Andrew Jackson;李大伟;;大麦条纹花叶病毒诱导的基因沉默载体系统的改造及其应用[A];中国植物病理学会2009年学术年会论文集[C];2009年

3 戴祯;武蓉;高飞;姚潮刚;韩杨;唐成程;赵致阳;逄大欣;;RNAi的毒性研究进展[A];全国动物生理生化第十二次学术交流会论文摘要汇编[C];2012年

4 魏红山;董庆鸣;刘顺爱;刘志英;郭晶晶;张四平;成军;;siRNA诱导HBV基因沉默空间结构与效应的关系[A];中华医学会第十二次全国病毒性肝炎及肝病学术会议论文汇编[C];2005年

5 林敏辉;胡建达;;NPM基因沉默对K562及其耐药细胞的作用研究[A];第四届全国血液肿瘤学术大会暨第七届全国淋巴肿瘤诊治进展研讨会论文汇编[C];2014年

6 吴丽娟;陈伟;康格非;蒋建新;朱佩芳;;锌指蛋白A20基因沉默载体研究与初步应用[A];第五次全国中青年检验医学学术会议论文汇编[C];2006年

7 陈伟;徐开林;潘秀英;;RNAi对小鼠T淋巴细胞BTLA基因沉默实验研究[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年

8 林敏辉;胡建达;;NPM基因沉默对K562及其耐药细胞的作用研究[A];第八届中国肿瘤学术大会暨第十三届海峡两岸肿瘤学术会议论文汇编[C];2014年

9 李云;相建海;Cunming Duan;;靶向基因沉默揭示了斑马鱼IGFBP-3在胚胎发育中的功能[A];中国海洋湖沼动物学会鱼类学分会第七届会员代表大会暨朱元鼎教授诞辰110周年庆学术研讨会学术论文摘要集[C];2006年

10 邱雪峰;董念国;胡平;史嘉玮;陈思;;组织因子小干扰RNA壳聚糖纳米粒的制备及其体外基因沉默作用[A];中华医学会第七次全国胸心血管外科学术会议暨2007中华医学会胸心血管外科青年医师论坛论文集心血管外科分册[C];2007年

相关重要报纸文章 前10条

1 本报记者 马爱平;“基因沉默”让美转基因苹果切开三周不变色[N];科技日报;2017年

2 本报记者 唐凤;探秘癌症基因“沉默”机制[N];中国科学报;2019年

3 首席记者 谭嘉;“基因剪刀”初露锋芒[N];健康报;2017年

4 记者 毛黎;科学家成功解开大量基因沉默之谜[N];科技日报;2008年

5 Esha Dey Pallavi Ail 编译 硕军;“基因沉默”先导者[N];医药经济报;2013年

6 本报记者 张佳星;基因跳跃 物种之间“征服战”[N];科技日报;2018年

7 李敏华;RNAi研发渐入佳境[N];医药经济报;2018年

8 肖嵘　苏玉文 湛意;将基因沉默理论用于硬皮病[N];健康报;2007年

9 聂翠蓉编译;RNAi：生物技术的蓝月亮[N];科技日报;2003年

10 闫洁 唐凤;《科学》评选2018年度十大突破[N];中国科学报;2018年

相关博士学位论文 前10条

1 靳晶豪;辣椒疫病抗性相关基因CaAP2/ERF的功能鉴定及调控机理研究[D];西北农林科技大学;2019年

2 杨玉;拟南芥SAC3B抑制基因沉默的机制研究[D];兰州大学;2015年

3 黄志伟;人参βAS和DS基因的克隆、原核表达与转化水稻的研究[D];福建农林大学;2013年

4 郭豫杰;猪Akirin2基因对C2C12细胞分化相关基因表达影响的研究[D];河南农业大学;2014年

5 徐晓武;DRP1基因沉默对人胃癌细胞生物学行为的影响和机制的初步研究[D];苏州大学;2018年

6 曹玉曼;蒺藜苜蓿磷转运体基因MtPT5和MtPT6功能研究[D];西北农林科技大学;2019年

7 朱海霞;LncRNA HOTAIR基因及其遗传变异与胃癌易感及预后的研究[D];南京医科大学;2019年

8 李珊;人类内源性逆转录病毒W家族env基因在神经细胞中过表达致KCNN3通道开放及TLR通路活化机制研究[D];武汉大学;2013年

9 王燕;COPB2基因沉默通过JNK/c-Jun信号通路抑制结直肠癌细胞增殖、诱导凋亡并提高细胞对常山酮的敏感性[D];兰州大学;2018年

10 孟晶晶;拟南芥MAT4通过影响表观遗传修饰调控基因沉默的机理研究[D];中国农业大学;2018年

相关硕士学位论文 前10条

1 姜美旭;基于转录组的陆地棉苗期耐盐分子基础初步解析及功能基因挖掘[D];河北农业大学;2019年

2 刘宇;耐冷候选基因OsRBCS3基因功能解析[D];黑龙江大学;2019年

3 张娜;TBC1D24基因新突变致2例儿童癫痫和耳聋的临床特点分析[D];青岛大学;2019年

4 柏鸽;植物OPA3-like基因功能的初步研究[D];石河子大学;2019年

5 石兴露;基因开关系统在两系杂交稻上的效果验证和应用研究[D];浙江大学;2019年

6 付洋;番茄APR基因在硫代谢通路中的功能及作用机制研究[D];合肥工业大学;2019年

7 窦浩文;Ebp1基因沉默对宫颈癌细胞增殖和侵袭转移的影响[D];延边大学;2019年

8 贺颖;add3基因沉默与轮状病毒共同作用致小鼠胆道闭锁作用机制的探讨[D];华中科技大学;2019年

9 刘杨;基因沉默精氨酰—tRNA合成酶减轻大脑皮层缺血性损伤的研究[D];华中科技大学;2019年

10 夏福林;Wnt3基因在结直肠癌发病中的作用机制研究[D];河南大学;2019年

本文编号：2697401