串联重复序列不同区段在小麦族染色体上的分布特点及小麦背景中簇毛麦染色体的鉴定

发布时间：2020-06-06 14:45

【摘要】：串联重复序列作为基因组的重要组成部分,大量存在于高等真核生物中。研究表明串联重复序列的变化能够对基因组以及染色体的结构产生重要的影响,进而导致基因功能的改变并使生物个体的性状发生改变。因此研究串联重复序列在染色体上的分布特点具有重要的意义。簇毛麦是小麦远缘杂交育种中常用的基因资源,因此在育种材料中鉴定小麦背景中的簇毛麦染色体也是十分重要的。本研究主要以小麦、黑麦、大麦、簇毛麦、八倍体小黑麦和小麦-簇毛麦双二倍体为材料,根据重复序列KU.D15.15、pSc119.2以及pTa71(rDNA)的4个重复序列家族设计寡核苷酸探针,对材料根尖中期染色体进行非变性荧光原位杂交(ND-FISH)分析,以研究串联重复序列不同区段在小麦族染色体上的分布特点以及快速准确地鉴定小麦背景中的簇毛麦染色体。具体研究结果如下:1.本研究根据重复序列KU.D15.15设计了寡核苷酸探针Oligo-Ku,同时设计了微卫星寡核苷酸探针(GT)_7。Oligo-Ku与(GT)_7相组合,能用于ND-FISH快速准确地鉴定出小麦背景中的簇毛麦染色体,寡核苷酸探针(GT)_7可以将7条簇毛麦染色体区分开。此外,探针Oligo-Ku也能识别小麦背景中的黑麦染色体。2.分析了来自小麦3B染色体上pSc119.2家族的序列3B.117(117bp),发现该序列被(T)n分隔为5个区段,根据这5个区段序列设计的7条寡核苷酸探针在相同的小麦、黑麦或簇毛麦染色体上呈现出了不同的信号强度以及不同的信号位点。同一条重复序列的不同区段在相同染色体上的不同位置的分布状态是不同的。3.为了探究其他pSc119.2家族序列是否也有这样的特征,从1B和3B染色体上随机寻找了6条pSc119.2家族序列。经分析发现这些序列也由(T)n分隔为5个区段,根据这些区段分别设计36条寡核苷酸探针,并用这些探针与中国春根尖染色体进行ND-FISH分析。结果同样发现由这6条pSc119.2家族序列不同区段设计的探针信号强弱不同,由第一、二、三和五区段设计的探针信号偏强,而第四区段的探针信号偏弱,且来自不同区段相同长度的探针产生的信号强弱不同,表明寡核苷酸探针信号强度与探针序列碱基构成有关。此外,由pSc119.2家族序列第五区段的整段序列设计的探针信号普遍很强,但由第五区段的部分区段设计的探针信号弱,这说明了寡核苷酸探针信号强度还与探针序列长度有关。4.小麦基因组中的pTa71有A、B、C、D四个不同的串联重复序列家族。提取这四个重复家族的重复单元序列,根据各重复单元的不同区段设计寡核苷酸探针,在小麦、大麦、黑麦和簇毛麦染色体上进行ND-FISH分析。结果发现,由pTa71的A家族设计的探针信号最强,而B、C、D家族的探针信号都很弱并且在不同染色体上也呈现出了信号强弱差异。此外,由pTa71的A家族重复单元设计的两条寡核苷酸探针(Oligo-pTa71A-1和Oligo-pTa71A-2)产生了不同的信号模式。Oligo-pTa71A-1和Oligo-pTa71A-2在小麦1B和6B染色体上有同样强的信号,但Oligo-pTa71A-1在黑麦1R和簇毛麦1V染色体上的信号却比Oligo-pTa71A-2的弱。5.为了探究由黑麦和簇毛麦中的rDNA重复序列是否也存在这样的差异,从黑麦和簇毛麦基因组中克隆出共4条与pTa71的A串联重复序列家族高度相似的序列71-R13-1、71-R4-1、71-R1-2、71-D7-6。将克隆的4条序列各分为三段,共设计了12条寡核苷酸探针,分别在黑麦和簇毛麦染色体进行ND-FISH分析。结果发现根据这4条序列的不同区段设计的寡核苷酸探针在黑麦和簇毛麦的1R和1V染色体产生的信号强弱也不同。推测该串联重复序列不同区段在中期染色体中存在的状态不同。本研究开发的寡核苷酸探针与ND-FISH分析相结合,能够方便地从小麦背景中鉴定簇毛麦染色体。另外发现根据同一串联重复序列不同区段设计的寡核苷酸探针在小麦族植物中期染色体产生的信号强弱以及信号位点的不同,反映了同一串联重复序列的不同区段在小麦族染色体上的分布状态不同。
【图文】：

此外，对绵麦 367 材料进行ND-FISH鉴定，寡核苷酸探针Oligo-Ku和(GT)7信号只出现在其6VS染色体臂上（图1C）。因此新设计开发出的寡核苷酸探针Oligo-Ku和(GT)7组合可以用于ND-FISH鉴定小麦和黑麦中的簇毛麦染色体。图 1 寡核苷酸探针 Oligo-Ku 和(GT)7的 ND-FISH 结果。(A) 寡核苷酸探针 Oligo-Ku（红色）在八倍体小黑麦 MK 染色体上的杂交结果，带红色信号的为黑麦染色体；(B) 核苷酸探针 Oligo-Ku和(GT)7在小麦-簇毛麦双二倍体材料 TDV-1 染色体上的杂交信号，带红色和绿色信号的为簇毛麦染色体；(C) 寡核苷酸探针 Oligo-Ku 和(GT)7在小麦品种绵麦 367 的染色体上的杂交信号；(D) 寡核苷酸探针(GT)7在簇毛麦 7 对染色体上的 ND-FISH 信号。注：所有染色体均用 DAPI 进行染色（蓝色），曝光时间 200ms。标尺：10μm。

3B.117串联重复序列是由本实验室从国际小麦测序中心（IWGSC）中国春小麦3B染色体测序数据库中找出，该串联重复序列与从黑麦中分离出的pSc119.2串联重复序列有94% 的相似度，因此它们属于同一个串联重复序列家族。如图2所示，3B.117序列可以通过红色显示的“(T)n”碱基序列将其分成5个区段。根据3B.117序列中这5个不同区段共设计了7条寡核苷酸探针（图2，表3），其中寡核苷酸探针Oligo-3B117.2(25bp) 是这 7 条探针中碱基序列最长的。而探针 Oligo-3B117.2.1 (15bp) 是探针Oligo-3B117.2 (25bp)的部分序列，与其他5条寡核苷酸探针的碱基序列长度相似。在3B.117 序列最后一个区段上，将其分成了两个部分并设计了寡核苷酸探针Oligo-3B117.6 和Oligo-3B117.1。分别将这些寡核苷酸探针在中国春小麦、黑麦PI428373和簇毛麦W6 21717的根尖细胞有丝分裂中期染色体上进行ND-FISH分析。图 2 由“(T)n”将 3B.117 串联重复序列分成 5 个区段，，设计 7 条寡核苷酸探针Fig.2 3B.117 tandem repeats divided into five segments by (T)n‖ and designed 7 oligonucleotideprobes.
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S512.1

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本文编号：2699834