水稻叶片衰老相关蛋白磷酸酶编码基因OsSAPP2、OsSAPP3功能分析

发布时间：2020-06-07 18:55

【摘要】：衰老是植物界普遍存在的一种自然现象,在植物整个生命周期中扮演着至关重要的角色,具有重要的生物学意义。植物在适应外界环境的过程中,蛋白磷酸酶调控多个蛋白激酶的可逆磷酸化过程来使植物适应外界环境。2C型蛋白磷酸酶(PP2C)是一类广泛存在于植物中的蛋白磷酸酶,通过脱磷酸化调控细胞的生长发育以及信号传递,从而调整体内相关基因的变化来对抗逆境胁迫。在前期研究中筛选出两个PP2C型蛋白磷酸酶编码的水稻基因OsSAPP2、OsSAPP3,获得相应的过表达转基因水稻,并获得相应的突变体。在本研究主要对水稻OsSAPP2和OsSAPP3功能进行分析。1.蛋白定位本试验构建了目标蛋白与EGFP的融合蛋白瞬时表达载体。通过对水稻原生质体进行亚细胞定位分析,结果显示OsSAPP2-GFP和OsSAPP3-GFP融合蛋白均定位于细胞膜上。2.OsSAPP2基因功能运用GUS组织化学染色法对Pro_(OsSAPP2)-GUS转基因植物中OsSAPP2启动子活性进行时空表达模式分析。研究结果得出,OsSAPP2基因在转基因水稻不同发育时期的叶、根、穗、茎等植物组织部位中均有活性。本试验对OsSAPP2启动子序列进行顺式作用元件分析发现其含有激素响应元件,推测其可能响应多种植物激素。试验结果也得出Pro_(OsSAPP2)-GUS转基因水稻可以对外源激素处理发生响应,外源施加同样浓度的ABA、ACC、SA和SL等激素可以显著促进Pro_(OsSAPP2)-GUS的表达,而施加相同浓度的6-BA、IAA和GA_3等激素则显著抑制Pro_(OsSAPP2)-GUS的表达;而施加相同浓度的JA和BR的影响不明显。本研究结果发现35S-OsSAPP2转基因水稻表现出叶面积和有效分蘖减小、抽穗提前以及光合指标和叶绿素含量降低,叶绿体结构发生异常,叶片比对照提前黄化早衰,叶绿素含量检测结果与表型相对应等早衰表型。还发现35S-OsSAPP2转基因水稻的穗重显著增加,但穗长显著减少,一次枝梗和二次枝梗中枝梗数、实粒数以及实粒重增加、但同时秕粒也增加,结实率下降,种子的粒宽和粒长增加,千粒重增加。对35S-OsSAPP2转基因水稻进行稻米品质的测定得到的结果35S-OsSAPP2转基因水稻在食味值和直链淀粉含量上要低于对照。结合前期实验过程中观察到的早衰表型变化,利用荧光定量RT-PCR检测转基因植物的分子机制变化发现,随着水稻叶片的衰老35S-OsSAPP2转基因水稻中衰老相关因子NAP基因和叶绿素降解相关基因PAO、NYC的表达量上调,且随着衰老的加剧表达量是升高的,光合作用相关基因PSaA、PSbA从抽穗期开始表达量下降。叶绿素合成相关基因CAO在蜡熟期时表达量降低。3.OsSAPP3基因功能经过外源诱导后的GVG-OsSAPP3转基因水稻同样表现早衰表型:光合指标降低,叶绿素含量降低、叶片比对照提前黄化早衰,叶绿体结构发生异常,叶绿素含量检测结果与表型相对应。结合前期实验过程中观察到的早衰表型变化,利用荧光定量RT-PCR检测转基因植物的分子机制变化发现,在经过12h的DEX诱导的GVG-OsSAPP3转基因水稻,衰老相关因子NAP基因和叶绿素降解相关基因PAO、NYC的表达量上调,且随着衰老的加剧表达量是上升的,光合作用相关基因PSaA、PSbA和叶绿素合成相关基因CAO表达量下调,且随着衰老的加剧表达量是下降的。4.突变体鉴定、表型分析将所获得OsSAPP2基因的突变体水稻种子进行基因型鉴定。结果发现,OsSAPP2基因的突变体水稻单株均为T-DNA杂合插入。田间表型观察发现,在分蘖期开始,OsSAPP2基因的突变体水稻的分蘖少,在完熟期OsSAPP2基因的突变体水稻大部分叶片还是绿色未衰老的状态。综合以上本文研究结果,我们认为过表达OsSAPP2和OsSAPP3基因可以导致转基因水稻叶片发生一系列的早衰表型,参与植物叶片衰老的调控,是正向调节因子。
【图文】：

图 1 OsSAPP2 蛋白的亚细胞定位A：左到右分别为荧光通道、明场、叠加图；B：左到右分别为 35S-OsSAPP2-GFP 蛋白荧光通道、明场、叠加图。（Bar=10μm）Fig1 Subcellular localization of OsSAPP2 proteinA: Left to right are GFP、Bright、Merged;B: Left to right are 35S-OsSAPP2-GFP protein GFP、Bright、Merged. (Bar=10μm)2.3.2 35S-OsSAPP2 转基因植株纯合筛选选取已经在前期实验中经过目的基因表达水平检测的 35S-OsSAPP2 转基因水稻，确定其为超表达株系：line1、line8、line48、line58 的 T2代种子和 SN9816 种子各 50 粒经过催芽后播种于苗床中。在苗床上培养三周左右，分别随机选取 30 棵 35S-OsSAPP2 转基因水稻苗提取其总 DNA，进行 PCR 扩增检测，以 SN9816 的 DNA 和水为阴性对照。部分结果显示（图 2）：line1、line8、line48、line58 所进行检测的 30 株苗在 500bp时均有目的片段，确定其均为阳性植株。并经过两年的的筛选与检测，确定 line1、line8、line48、line58 四个株系为纯合株系，选取 20 株苗每四株插于一个盆栽桶中，并对其进行后续的实验指标的测定。

图 1 OsSAPP2 蛋白的亚细胞定位A：左到右分别为荧光通道、明场、叠加图；B：左到右分别为 35S-OsSAPP2-GFP 蛋白荧光通道、明场、叠加图。（Bar=10μm）Fig1 Subcellular localization of OsSAPP2 proteinA: Left to right are GFP、Bright、Merged;B: Left to right are 35S-OsSAPP2-GFP protein GFP、Bright、Merged. (Bar=10μm)2.3.2 35S-OsSAPP2 转基因植株纯合筛选选取已经在前期实验中经过目的基因表达水平检测的 35S-OsSAPP2 转基因水稻，确定其为超表达株系：line1、line8、line48、line58 的 T2代种子和 SN9816 种子各 50 粒经过催芽后播种于苗床中。在苗床上培养三周左右，分别随机选取 30 棵 35S-OsSAPP2 转基因水稻苗提取其总 DNA，进行 PCR 扩增检测，以 SN9816 的 DNA 和水为阴性对照。部分结果显示（图 2）：line1、line8、line48、line58 所进行检测的 30 株苗在 500bp时均有目的片段，确定其均为阳性植株。并经过两年的的筛选与检测，确定 line1、line8、line48、line58 四个株系为纯合株系，选取 20 株苗每四株插于一个盆栽桶中，，并对其进行后续的实验指标的测定。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S511

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本文编号：2701856