小麦耐逆因子TaMIR9658、TaMIR9773、TaMIR167a和TaCDPK17特征及功能鉴定

发布时间：2020-06-09 00:56

【摘要】：增强植株抵御盐分和养分缺乏非生物胁迫逆境功能,对于改善作物生长、发育及产量形成能力具有重要意义。本研究在前期实验室工作的基础上,以鉴定的低氮、低磷和盐分胁迫产生应答的小麦耐逆因子TaMIR9658、TaMIR9773、TaMIR167a和TaCDPK17为基础,对上述耐逆因子分子特征及介导植株抵御非生物逆境的功能进行了研究,主要结果如下:1.低氮胁迫下,小麦小分子RNA成员TaMIR9658的表达水平升高,在处理后12 h时,表达量最高。采用琼脂糖培养、溶液培养及土培培养试验结果表明,在正常条件下,该小分子转基因株系生长与野生型(WT)相比没有改变;低氮处理下,与WT相比,正义系植株长势增强,叶面积及植株形态增大,反义系则长势减弱,叶面积及植株形态变小。表明TaMIR9658在植株适应低氮胁迫中发挥正调节作用。基因表达分析表明,低氮胁迫下,硝酸盐转运蛋白基因NTNRT2.1和NTNRT2.2、硝酸还原酶基因NtNR1、亚硝酸还原酶基因NtNIR3、谷氨酰胺合成酶基因NtGS2、NtGS8和NtGS9在正义系中表达上调,在反义系中表达下调。此外,细胞保护酶基因SOD1、POD1;4、POD4、POD1;7、CAT1;1正义系表达上调,反义系表达下调。表明TaMIR9658介导植株抵御低氮逆境与其改善氮素吸收及增强细胞活性氧稳态有关。2.TaMIR9773在盐分胁迫下呈上调表达,在处理后12 h时呈明显上调。正常条件下,TaMIR9773转基因系与野生型相比生长特征相近。盐分胁迫处理下,正义系形态较WT显著增大,叶片数增多;反义系植株形态较WT变小,叶片小而少。其气孔开度观测结果表明,盐分胁迫下,正义系的气孔关闭进程较WT加快。表明TaMIR9773增强植株抵盐分逆境的能力,与其调控气孔开闭及细胞水势生理过程有关。3.采用TaMIR167a正义系、其靶基因NtARF6和NtARF8反义系研究了供试miRNA介导植株抵御低磷逆境的能力。在正常生长及低磷处理下,供试转基因株系的表型均较WT减小,生物量与WT相比也降低。表明miRNA167a在植物生长和应答低磷逆境中发挥负调节作用。其中,低磷条件下转化株系与WT相比的植株生长抑制程度与正常生长条件相比增大。研究表明,该小分子介导植株对低磷逆境的应答与其调控细胞保护酶特定基因表达进而影响细胞活性氧稳态有关。4.TaCDPK17全长为1575kb,编码氨基酸数目为194个,等电点为9.11。TaCDPK17编码蛋白具有信号肽,信号肽的剪切位点位于第29和第30号氨基酸之间。TaCDPK17与TaCDPK10在核苷酸水平上高度相似,说明上述基因具有相似的进化途径。在低磷胁迫处理下,与WT相比,超表达TaCDPK17正义系植株长势增强,叶片数增多;该基因反义系则长势减弱,叶片数减少。表明TaCDPK17在介导植株抵御低磷胁迫过程中发挥着重要功能。综上所述,小麦种属miRNA家族成员(TaMIR9658、TaMIR9773和TaMIR167a)和钙依赖蛋白激酶家族成员TaCDPK17在介导植物抵御非生物胁迫中发挥重要生物学功能。研究对于揭示小麦的耐盐性,抵抗低氮和低磷的分子机制及今后为小麦遗传改良和生产实践提供了理论依据。
【图文】：

2.6.1.2 TaMIR9658 和 TaMIR167 转基因系中活性氧清除相关基因的表达模式非生物胁迫诱发活性氧（ROS）产生，造成细胞膜质过氧化程度加剧、细胞功能衰退和植株受到伤害。以用鉴定上述植株氮素吸收同化相关基因表达的 cDNA 样品，对低氮胁迫下TaMIR9658 和低磷处理下 TaMIR167 转化株系的烟草细胞保护酶编码基因（超氧化物气化酶SOD、过氧化物酶 POD 和过氧化氢酶 CAT）的转录本丰度进行了检测。供试 SOD 家族基因 5个，包括 NtSOD1、NtSOD2、NtFeSOD、NtMnSOD1和 NtMnSOD2）；POD 家族基因 11 个，包 括 NtPOD1;1、 NtPOD1;2、 NtPOD1;3、 NtPOD1;4、 NtPOD4、 NtPOD1;5、 NtPOD1;6、NtPOD1;7、NtPOD2;1、NtPOD2;2 和 NtPOD9；CAT 家族基因 6 个，包括 NtCAT、NtCAT-1、NtCAT1、NtCAT1;1、NtCAT1;2、NtCAT1;3 和 NtCAT3。用于扩增上述基因的特异引物见图 2-2。图 2-1 用于 NRT、NR、NIR 和 GS基因扩增的引物Figure 2-1 Primers used for amplification of NRT, NR, NIR and GS familygenes

2.6.1.3 TaMIR9658 和 TaMIR167 转基因株系活性氧相关参数活性测定以低氮处理后 TaMIR9658和低磷处理后 TaMIR167转化株系为材料，进行细胞保护酶活和丙二醛含量的测定。其中，SOD活性采用周琦（2004）[137]的氮蓝四唑（NBT）法测定；OD 活性采用高俊凤（2006）[138]的愈创木酚法测定；CAT活性采用邹琦等（2004）[137]的紫分光比色法测定；MDA 含量采用高俊凤（2006）[138]的硫代巴比妥酸比色法测定。2.6.2 TaMIR9773 盐分胁迫下的气孔特征研究在盐分胁迫下，，因胁迫诱导的细胞渗透性失水，造成细胞的生理代谢过程受到影响。为了抗盐胁迫，植物通过适应性调整增强对环境的适应性和抵御能力。其中，气孔开闭调节细胞势和叶片蒸腾速率是植株适应盐分胁迫的重要生理机制。为阐明 TaMIR9773 调控叶片气孔答盐分逆境特征，以 WT和该小分子 RNA转化株系为材料，观测 6叶龄植株 NaCl（200M）处理后不同时间点（处理前 0 min 和处理后 30 min、1 h、2 h 和 3h）的叶片气孔开度。图 2-2 扩增 SOD、CAT和 POD基因的特异性引物Figure 2-2 Primers used for amplification of SOD, CAT, and POD family genes
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S512.1

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