外源壳聚糖对甘草代谢组与蛋白质组的影响及GuHMGR、GuSQS、Guβ-AS工程菌的构建研究

发布时间：2020-06-13 05:32

【摘要】：甘草(Glycyrrhiza ural ensis Fisch)是豆科多年生草本植物,其根和根茎入药,具有补脾益气,清热解毒,祛痰止咳,调和诸药等功效。目前甘草野生资源匮乏,而现阶段栽培甘草与野生甘草质量存在较大差距。以甘草酸为代表的三萜类及以甘草苷为代表的黄酮类这两大类主要药效成分均存在含量低下的问题。因此提高栽培甘草品质势在必行。壳聚糖是一种真菌代谢物,广泛的应用于农业中用于提高农作物的产量,另外,作为诱导子广泛地应用于药用植物的次生代谢调控过程中。目前,尚无壳聚糖诱导调控甘草次生代谢的报道。因此我们利用外源壳聚糖诱导甘草整体植物,从代谢组学与蛋白组学两方面研究其对甘草代谢的影响。另外,本论文对甘草酸生合成关键酶GuHMG R、GuSQS、Guβ-AS进行了工程菌的构建。结果如下:(1)基于LC-MS/MS的甘草次生代谢研究发现壳聚糖诱导后,甘草苷含量显著增加,而甘草酸含量无明显变化。结合多元统计学分析共筛选鉴定出34个差异代谢物。其中18个黄酮类物质均显著升高,包括10个黄酮、6个异黄酮、2个查尔酮。黄酮类物质的变化极具规律性,认为壳聚糖诱导促进了黄酮类物质的生物合成。而萜类物质的变化规律不明显。(2)基于NMR的甘草初生代谢研究发现壳聚糖诱导后,筛选鉴定出7个差异初生代谢物,其中包括4个氨基酸、3个有机酸类化合物,这7物质均直接或间接的参与到三羧酸循环中,我们推测,壳聚糖诱导促进了三羧酸循环。(3)基于ELISA的甘草激素含量测定发现,壳聚糖诱导后脱落酸(ABA)含量显著降低,其它四种激素,生长素(IAA)、赤霉素(GA3、GA4)、茉莉酸甲酯(MeJA)的含量均显著升高。(4)基于iTRAQ的蛋白质组学研究发现壳聚糖诱导后,461个蛋白质被鉴定为差异蛋白,其中201个差异蛋白表达被下调,包括光合作用相关蛋白(LHCA类、LHCB类、Psa类、Psb类、Pst类、atp类蛋白),260个差异蛋白表达被上调,包括苯丙素生合成途径相关蛋白(PAL)、黄酮生合成途径相关蛋白(PAL、CHS、PKR、CHI、VR);差异蛋白的GO注释及功能富集提示,甘草光合作用、次生代谢过程等生物学过程被显著富集;甘草光合作用场所类囊体、质体或色素体等细胞定位被显著富集,结合差异蛋白定量研究结果,共同说明:壳聚糖诱导减弱了甘草光合作用电子传递过程;差异蛋白的KEGG通路注释及功能富集分析提示:甘草光合作用、光合作用天线蛋白、苯丙素生合成途径生合成途径被显著富集到;结合差异蛋白定量研究结果,共同说明:壳聚糖诱导显著的抑制了甘草的光合作用。(5)基于前人构建的GuHMGR、GuSQS、Guβ-AS的克隆载体,采用不同的表达载体构建方法,均成功的构建表达载体,进而构建GuHMGR、GuSQS、Guβ-AS的大肠杆菌工程菌,且成功的表达出了 GuHMGR、GuSQS、Guβ-AS。综上所述,壳聚糖对甘草代谢的影响总结如下(1)壳聚糖诱导引起三羧酸循环(TCA)的增强,TCA循环为次生代谢产物的合成提供充足的底物,因而一方面促进了甘草黄酮的生物合成,另一方面促进了甘草内源激素的合成。(2)TCA循环的增强显著上调了 PAL、CHS、PKR、CHI、VR这五个贯穿甘草黄酮生合成始终的酶,导致甘草黄酮整条代谢途径被激活。所以,PAL、CHS、PKR、CHI、VR可能是甘草黄酮提高的关键所在。(3)甘草黄酮提高的同时,对自身的光合作用产生了反馈抑制,使甘草光合作用相关酶(LHCA类、LHCB类、Psa类、Psb类、Pst类、atp类蛋白)显著下调;甘草光合作用相关酶显著下调另一方面也可能是由于响应甘草内源激素(IAA、GA3、GA4、MeJA)水平的改变所致。本研究为甘草的次生代谢调控奠定基础,而且为GuHMGR、GuSQS、Guβ-AS的功能研究及体外研究奠定基础。为甘草品质的提高提供参考,为其它药用植物资源的次生代谢调控提供借鉴。
【图文】：

途径,半萜,三萜类,糖酵解

萜类化合物是植物界广泛存在的一类化合物，是由异戊二烯为基本单位组成的聚逡逑合物及其衍生物的总称。蔽类化合物合成途径之一是甲轻戊酸（Ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ邋ｐａｔｈｗａｙ，逡逑ＭＶＡ）途径，见图１－１。逡逑ｒ邋—逡逑ｒｒ邋Ｔ逡逑W—逦逡逑图１－１邋ＭＶＡ途径逡逑ＭＶＡ途径在植物的细胞质中进行［６２］，以糖酵解产物乙酰辅酶Ａ为原初供体，合成倍逡逑半萜、三萜类等化合物。萜类化合物还有另外一条生合成途径－３－磷酸甘油醛／丙酮酸逡逑途径（甘油醛磷酸／丙酮酸途径，ＤＸＰ），主要在质体中进行。以戊糖磷酸途径产生的甘逡逑油醛－３－磷酸为原初供体，合成单萜，二萜，多萜类等化合物。异戊烯基焦磷酸（ＩＰ逡逑Ｐ）形成机制的不同是以上两条途径的不同之处。各种萜类化合物的形成主要起始于ＩＰ逡逑Ｐ和ＤＭＡＰＰ，，１分子ＩＰＰ作为活化的异戊二烯单元，与１分子它的异构体丫，丫－二甲基逡逑丙烯酯（ＤＭＡＰＰ）头尾缩合生成具有１０个碳结构骨架的牦牛儿基焦磷酸（ＧＰＰ），ＧＰＰ加逡逑上第二个ＩＰＰ单元形成法尼基焦磷酸（ＦＰＰ）。ＦＰＰ与其异构体焦磷酸苦橙油酯聚合可形逡逑１８逡逑

路线,构建技术,研究方案,甘草

２．４研宄方案与技术路线逡逑２．邋４．１技术路线逡逑见图２－１如下所示逡逑Ａ逡逑逦邋ＥＬＩＳＡ逦逦逡逑次生代邋ＬＣ＿邋＿差异代谢物———逡逑，——逦＾逦谢物逦ＭＳ／ＭＳ逦含眚变化逡逑外邋＾逦＿逦逡逑谢＿初生代逦ＮＭＲ逦差异代逡逑组逦谢物逦谢物代逦壳逡逑充逦学逦逦邋谢途径逦聚逡逑聚逦糖逡逑办逦诱逡逑糖逦导逡逑诱逦对逡逑导逦Ｚ逡逑甘逦代逡逑革逦谢逡逑１逦白功能〕逦ｊ逡逑其逦—＾逦影逡逑＾逦＾逦ｉＴＲＡＱ邋￣￣逦响逡逑２逦Ｉ逦￣！标记逦蛋白聚类逡逑饭逦曰—逦逡逑Ａｊｎ逦ｉＳｉ逦逦＾邋ＬＣ逦（逦＾逡逑线ｉ逦ＭＳ／ＭＳ逦差异蛋白质逡逑丨、含量变化逡逑逦逡逑２５逡逑
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S567.71

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