BnGRF7c基因的功能研究及其SNP分子标记开发

发布时间：2020-06-16 19:32

【摘要】：甘蓝型油菜(Brassica napus L.)是我国重要的油料作物,不仅可生产食用油,而且其饼粕富含蛋白质,也可作为动物饲料。种子大小(千粒重)是产量的重要决定因素之一,寻找并研究控制种子大小的基因及其功能性SNPs对促进分子设计育种的发展、提高油菜籽产量具有深远的意义。本研究基于具有324个油菜种质资源的自然群体,对甘蓝型油菜生长调控因子家族(growth regulating-factors,GRFs)中的35个基因进行了千粒重的关联分析,检测到33个与种子千粒重显著相关的SNPs位点,这些SNPs位点主要分布于BnaC02g44780D基因区域,由于它是生长调控因子7中的一个基因,我们将它命名为BnGRF7c。本研究以BnGRF7c为切入点,对其进行生物信息学分析、生物学特征分析、表达谱分析和功能验证等方面的研究,本研究的主要结果如下:(1)本研究从具有324个油菜种质资源的自然群体中,分别选择千粒重大的材料(4.17~5.52g)和千粒重小的材料(2.83~3.55g)作为分组,采用三种方法,即Fst(Fixation index)分析、θPi分析和Tajima’D分析,对BnGRF7c进行选择压力分析。结果显示BnGRF7c在育种过程中受到了正选择,推测其可能是油菜育种中一个至关重要的功能基因。组织特异性表达模式分析结果表明,BnGRF7c在油菜茎尖和发育中的种子中的表达水平较高,与关联分析结果在一定程度上相吻合,证实BnGRF7c与种子发育有关。(2)构建了pK7FWG2.0-BnGRF7c-eGFP植物融合表达载体,利用农杆菌介导的烟草瞬时表达系统对BnGRF7c编码的蛋白进行亚细胞定位分析,结果显示BnGRF7c蛋白分布于烟草表皮细胞的细胞核中,与预测结果相一致,表明它在油菜的生长发育过程中以转录因子的身份发挥作用,调控油菜的生长,从而影响油菜的种子大小。(3)构建了pBI121-BnGRF7c过表达载体,通过农杆菌介导的浸花法遗传转化拟南芥,经筛选得到阳性的转基因拟南芥植株。过表达植株表型调查结果表明,与野生型相比,其叶片面积、花瓣面积、角果长度和种子大小均明显增加,证实BnGRF7c确实可以调控种子大小。为进一步验证BnGRF7c基因的功能,使用CRISPR-Cas9基因编辑系统对BnGRF7c基因进行敲除,然后利用下胚轴遗传转化体系将基因敲除载体BnGRF7c-Cas9转化到甘蓝型油菜中,并针对不同的油菜品种将转化体系进行了相应优化,经筛选鉴定已获得阳性株,其功能有待于后续进一步验证。研究结果表明,BnGRF7c蛋白定位于细胞核中,在油菜的生长发育过程中以转录调控因子的身份发挥作用,推测其可能以参与细胞分裂调控的方式来影响油菜的种子发育,从而调控油菜的种子大小。筛选到几个在具有大种子的油菜种质中呈现较强规律性的SNPs位点,通过PCR反应程序优化,检测到SNP chrC02_random_566683位点可用于油菜分子设计育种中大量样本的筛选。上述研究结果不仅揭示了植物转录调控因子与植物生长过程及种子发育之间的关系,为研究植物种子发育提供理论依据,同时对植物种子大小的遗传改良、高产油菜品种的选育也具有重要的指导意义。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S565.4
【图文】：

植物种子,转录抑制,水稻

BnGRF7c 基因的功能研究及其 SNP 分子标记开发表 1.1 (续)Table 1.1 (continued)途径蛋白名称物种名称蛋白质类别功能丧失的表型参考文献HvDep1 大麦 G 蛋白 γ 亚基的同源基因小谷粒[49]转录调控因子BS1 豆科转录调节因子大种子 [50]GW8 水稻 SBP 家族转录因子；OsSPL16 窄谷粒 [51]GS2 水稻生长调控因子 4 小谷粒 [52;53]OsGIF1 水稻 GRF 互作蛋白 1 小谷粒 [54]SOD7 拟南芥 B3 结构域转录抑制因子大种子 [53]NGAL3 拟南芥 B3 结构域转录抑制因子大种子 [56]

染色体C,甘蓝型油菜,位置,步长

般 Fst 值越大，表明两个亚组分化越严重，从而说明该区域在两个亚组中发生明显分化，则该区域为种子大小的受选择区域。(2) θPi 分析，窗口 20 kb，步长 2 kb，计算两组材料的遗传多样性 Pi，如果两组材料某个区域的 Pi 差异显著，则比值会偏高或偏低，说明该区域受选择。(3) Tajima’s D 分析，是基于群体中性进化的分析，窗口 20 kb，没有步长，若Tajima’sD 值大于 0，显示有很多中频等位基因出现在这个窗口，可推测为平衡选择；若 Tajima’sD 值小于 0，显示有很多低频等位基因出现在这个窗口，可推测为定向选择。总之，Tajima’s D 值越偏离 0，受选择程度越高。虽然三种分析方法的窗口均为 20 kb，而且其中 Tajima’s D 分析没有步长，但是如图 2.1 所示，BnGRF7c 基因上游 22 kb 及下游 8 kb 区域内无其他基因(来源于数据库 GENOSCOPE)，因此可以排除干扰。

【参考文献】