基于花粉管通道法的玉米骨干自交系ALS基因编辑技术研究

发布时间：2020-06-18 03:05

【摘要】：本研究以玉米骨干自交系为材料,采用穿膜肽介导的花粉管导入技术对几种重要玉米骨干自交系中的乙酰乳酸合成酶ALS基因进行了定点突变的基因编辑研究,旨在初步建立不依赖于基因型的玉米基因编辑技术体系,为玉米分子育种奠定基础。通过大规模苗期除草剂筛选,得到了抗苯磺隆的后代植株,靶点测序结果初步证实了通过花粉管导入DNA可实现基因定点编辑,且ALS基因的定点突变可用于除草剂抗性筛选。用编辑后的除草剂抗性基因作为筛选标记,极大提高了花粉管导入法基因编辑后代的鉴定效率。为了在培育抗除草剂突变体材料过程中选择合适的受体材料及除草剂筛选浓度,以7个玉米骨干自交系C92、京724、京2416、B73、郑58、HZ178和178为材料,研究了各自交系材料对苯磺隆和甲咪唑烟酸的敏感性差异。测定不同除草剂浓度处理下各自交系的初生根长受抑制率、幼苗生长受抑制率和乙酰乳酸合成酶(ALS)活性。结果显示:随着两种除草剂处理浓度的增加,各自交系材料的初生根长受抑制率和幼苗生长受抑制率明显提高,且各自交系材料ALS酶活性存在不同程度的下降趋势;7个自交系材料对两种除草剂的敏感性高低均为:C92京724京2416B73郑58HZ178178;相比较苯磺隆各自交系材料对甲咪唑烟酸更加敏感。综上所述,自交系C92、京724和京2416相比较B73、郑58、178和HZ178对苯磺隆及甲咪唑烟酸更加敏感,适合作为ALS基因编辑获得抗除草剂突变体的受体材料,苯磺隆和甲咪唑烟酸的筛选浓度分别为334mg/L与120mg/L。试验采用花粉管导入法将编辑玉米ALS基因的质粒载体(pBUE911)导入玉米自交系。通过除草剂苯磺隆(334mg/L)筛选获得22株T_0代抗性株系,分子检测及测序验证证明ALS基因靶点得到了定点突变,对突变体自交后代靶位点测序分析,证实编辑突变情况可以有效遗传。试验选出抗性较强的7个T2代突变体株系,对其苯磺隆抗性、乙酰乳酸合成酶(ALS)活性进行了鉴定和测量。结果显示:在除草剂苯磺隆处理下,与对照相比,发现不同时期突变株系的根长、侧根数、鲜干重、株高、茎粗及叶面积等相关形态学指标明显增加,表现出较好生长状况,并且突变体中乙酰乳酸合成酶活性无明显下降。以上结果表明ALS基因靶位点经过基因编辑定点突变后,部分编码氨基酸发生改变,使其与对照自交系相比能够对ALS抑制剂类除草剂产生一定抗性。
【学位授予单位】：长江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S513
【图文】：

3.3 结果与分析.3.1 基因编辑表达载体构建酶切验证.3.1.1 质粒载体pBUE911与pEasy-blunt酶切图载体经过热击转化大肠杆菌后提取质粒，用内切酶BsaI对pBUE911，将壮观霉素抗性基因SpR切下，片段大小为1218bp，回收大片段；用indⅢ对pEasy-blunt进行酶切，切下片段大小为546bp，回收大片段，酶如下所示。

3.3.1.1 质粒载体pBUE911与pEasy-blunt酶切图载体经过热击转化大肠杆菌后提取质粒，用内切酶BsaI对pBUE91切，将壮观霉素抗性基因SpR切下，片段大小为1218bp，回收大片段；用HindⅢ对pEasy-blunt进行酶切，切下片段大小为546bp，回收大片段，酶图如下所示。图 3-1 质粒 pBUE911 酶切Fig.3-1 plasmid pBUE911 Enzyme Cutting

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本文编号：2718593