棉花非生物胁迫响应基因GhWRKY6的功能验证及调控机制的研究
发布时间：2020-06-20 18:30
【摘要】：棉花是我国最重要的经济作物之一,在我国的种植历史优久,但长期以来,棉花产量的增加和纤维品质的提升受到极端环境条件的限制,其中以干旱和高盐胁迫影响最为严重。因此发掘棉花抗逆的关键基因,研究棉花的抗逆分子机制,创制更加耐盐耐旱的棉花新品种对我国棉花产业的发展具有重要意义。WRKY转录因子是植物特有的一个转录因子家族,广泛参与植物的生物与非生物胁迫响应中。在本研究中首次鉴定并克隆得到一个棉花WRKY家族转录因子,利用转基因技术对该基因功能进行验证,利用转录组数据对其调控机制进行研究。本研究获得的主要结果如下:1.目的基因克隆及序列分析。目的基因GhWRKY6核酸序列全长1575 bp,包含有6个外显子,525个氨基酸,在靠近N端的位置有一个WRKY保守结构域。蛋白序列比对表明其与拟南芥AtWRKY6互为同源基因。2.基因表达模式的分析。利用qRT-PCR分析GhWRKY6在棉花不同组织中的表达量,发现该基因在根、茎、叶组织中表达量很高,但在其他组织中表达量极低,尤其是胚珠中,说明GhWRKY6具有较明显的组织表达特异性;在ABA、NaCl和PEG6000处理下,GhWRKY6的表达量均有明显升高,说明GhWRKY6的表达受非生物胁迫诱导。3.GhWRKY6转基因拟南芥对非生物胁迫敏感。在ABA、高盐和干旱处理条件下,GhWRKY6转基因拟南芥与野生型拟南芥相比,种子萌发率下降、生物量降低、主根缩短、过氧化物的积累和电导率增加、气孔开度较大,说明在拟南芥中过表达GhWRKY6基因增加了拟南芥对ABA、高盐和干旱胁迫的敏感性。4.利用VIGS技术干涉GhWRKY6在棉花中的表达发现,降低GhWRKY6的表达量,棉花对盐胁迫的耐受性有所增加。TRV::GhWRKY6株系比对照株系在高盐胁迫下具有更低的盐害指标和失水率,过氧化物积累也明显减少,说明GhWRKY6在棉花盐胁迫反应过程中起负调控作用。5.对TRV::GhWRKY6和TRV::00分别进行RNA-Seq分析发现,两者之间筛选出494个显著上调表达的基因,1372个显著下调表达的基因。GO(Gene ontology)分析显示显著上调表达的基因主要富集在氧化还原过程、膜成分、应激反应和脯氨酸生物合成过程等通路中;显著下调表达基因主要在核小体成分、核小体组装、氧化还原过程和代谢过程等通路中。GhWRKY6在棉花非生物胁迫响应调控网络中除了涉及到ABA信号途径之外,其他的信号通路也可能受GhWRKY6的影响。本研究通过过表达和基因干涉技术对GhWRKY6的功能进行了验证,从植物表型到细胞代谢水平再到基因转录水平逐步深入的揭示了GhWRKY6作为负调控因子在植物应答干旱和高盐胁迫过程中发挥重要作用。
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S562
【图文】：
棉花非生物胁迫响应基因 GhWRKY6 的功能验证及调控机制的研究3. 结果与分析3.1 棉花 GhWRKY6 基因的克隆使用 RNAprepPure 多糖多酚植物总 RNA 提取试剂盒（天根）提取陆地棉中棉4 组织的总 RNA，配置浓度为 1%的琼脂糖凝胶电泳检测提取的 RNA 的质量。使胶成像系统观察胶块上的条带，可以看到 28S 和 18S 两条清晰的条带，且前者的是后者的 1.5 到 2 倍。使用 NanDrop2000 测定 RNA 的 OD260/280 比值，结果均.8-2.1 之间，说明提取的 RNA 质量较高，没有蛋白杂质等物质的污染（图 1-A）。到的总 RNA 反转录成 cDNA 作为 PCR 模板，1%的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR ，得到 1575 bp 的目的条带（图 1-B），经测序得到 PCR 产物的序列并与参考基序列进行比对，发现两者核酸序列几乎完全匹配。
图 2 GhWRKY6 基因的结构分析Fig 2. Structural analysis of the GhWRKY6 geneA GhWRKY6 基因结构；B WRKY 保守结构域的位置A GhWRKY6 gene structure; B Position of WRKY conserved domain3.3 GhWRKY6 编码的蛋白序列分析及进化分析在 EXPASY 网站上的 ProtParam 对 GhWRKY6 基因编码蛋白进行理化性质分析，结果表明，该蛋白的理论相对分子质量为 57.629 kD，理论等电点为 6.95，分子式为C2444H3919N761O804S25，脂肪酸系数为 66.15，平均亲水性为-0.772，不稳定系数为 41.0，根据 Guruprasad 等方法的计算结果表明该蛋白为不稳定蛋白。利用 SignalP4.0 Server通过人工神经网络算法对 GhWRKY6 基因编码蛋白进行信号肽预测，该蛋白的 N 端至第 70 位氨基酸之间剪切位点分值（C-Value）和综合剪切分值（Y-Value）无明显峰值，说明该蛋白的 N 端不存在剪切位点，表明其不包含信号肽，推测其为非分泌蛋白。利用 TMHMM2.0SERVER 对 GhWRKY6 基因编码蛋白进行跨膜结构预测，其中1~525 个氨基酸没有峰值表明不存在跨膜蛋白，因此推测其不具有跨膜结构为细胞膜
本文编号：2722799
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S562
【图文】：
棉花非生物胁迫响应基因 GhWRKY6 的功能验证及调控机制的研究3. 结果与分析3.1 棉花 GhWRKY6 基因的克隆使用 RNAprepPure 多糖多酚植物总 RNA 提取试剂盒（天根）提取陆地棉中棉4 组织的总 RNA，配置浓度为 1%的琼脂糖凝胶电泳检测提取的 RNA 的质量。使胶成像系统观察胶块上的条带，可以看到 28S 和 18S 两条清晰的条带，且前者的是后者的 1.5 到 2 倍。使用 NanDrop2000 测定 RNA 的 OD260/280 比值，结果均.8-2.1 之间，说明提取的 RNA 质量较高，没有蛋白杂质等物质的污染（图 1-A）。到的总 RNA 反转录成 cDNA 作为 PCR 模板，1%的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR ，得到 1575 bp 的目的条带（图 1-B），经测序得到 PCR 产物的序列并与参考基序列进行比对，发现两者核酸序列几乎完全匹配。
图 2 GhWRKY6 基因的结构分析Fig 2. Structural analysis of the GhWRKY6 geneA GhWRKY6 基因结构；B WRKY 保守结构域的位置A GhWRKY6 gene structure; B Position of WRKY conserved domain3.3 GhWRKY6 编码的蛋白序列分析及进化分析在 EXPASY 网站上的 ProtParam 对 GhWRKY6 基因编码蛋白进行理化性质分析，结果表明，该蛋白的理论相对分子质量为 57.629 kD，理论等电点为 6.95，分子式为C2444H3919N761O804S25，脂肪酸系数为 66.15，平均亲水性为-0.772，不稳定系数为 41.0，根据 Guruprasad 等方法的计算结果表明该蛋白为不稳定蛋白。利用 SignalP4.0 Server通过人工神经网络算法对 GhWRKY6 基因编码蛋白进行信号肽预测，该蛋白的 N 端至第 70 位氨基酸之间剪切位点分值（C-Value）和综合剪切分值（Y-Value）无明显峰值，说明该蛋白的 N 端不存在剪切位点，表明其不包含信号肽，推测其为非分泌蛋白。利用 TMHMM2.0SERVER 对 GhWRKY6 基因编码蛋白进行跨膜结构预测，其中1~525 个氨基酸没有峰值表明不存在跨膜蛋白，因此推测其不具有跨膜结构为细胞膜
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本文编号：2722799
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