紫花苜蓿对低磷胁迫的响应及相关miRNAs的功能分析

发布时间：2020-07-05 22:22

【摘要】：土壤有效磷缺乏严重影响了作物的生长发育,农业生产上主要通过施用磷肥增加土壤有效磷,但即将枯竭的磷矿资源迫使我们从植物自身提高磷吸收利用效率。为探索苜蓿磷高效吸收利用相应的策略及调控通路,本研究将以紫花苜蓿为材料,分析耐低磷较强的耐盐之星品种低磷生理与形态响应,以及运用组学技术、生物信息学和分子生物学等手段从miRNA水平深入研究紫花苜蓿低磷应激机制。本研究包括3部分试验:(1)耐低磷紫花苜蓿品种的筛选:利用隶属函数方法综合评价25个国内外紫花苜蓿品种的耐低磷性;(2)苜蓿对低磷胁迫的生理与形态响应分析:分别检测常磷(0.5 mmol/L KH_2PO_4)与低磷(5μmol/L KH_2PO_4)下紫花苜蓿生理与形态变化;(3)低磷应激miRNAs的鉴定及功能分析:利用Illumina 2500高通量测序平台分析常磷和低磷条件下差异表达的miRNAs,并分析靶基因功能以及可能参与的调控通路。主要得到以下结果与结论:1.检测了低磷处理30 d紫花苜蓿的茎叶干重、株高、根干重、根冠比、总根长、根表面积、全磷含量、磷利用率以及酸性磷酸酶活性,进一步利用主成分分析浓缩为3个新的相互独立的综合指标,评价结果显示敖汉、皇冠、耐盐之星等的耐低磷性较强。2.低磷胁迫下,耐低磷较强的苜蓿(耐盐之星)地上部分和地下部分生长都受到抑制,但根冠比显著增加(P0.05);根组织中的酸性磷酸酶活性增强,低磷胁迫20 d时根中的柠檬酸、苹果酸、琥珀酸分别是对照的4.14、2.67、2.09倍;综合表明,紫花苜蓿可能通过增加根冠比、提高酸性磷酸酶活性以及分泌有机酸应对低磷环境。3.分别构建了耐盐之星常磷根(NPR)、低磷根(LPR)、常磷茎叶(NPS)和低磷茎叶(LPS)小RNA文库,每个文库3个生物学重复,高通量测序共鉴定到264个已知miRNAs和157个新miRNAs,根和茎叶中分别检测到47个和44个差异表达的miRNAs,其中包括低磷诱导上调的miR399、miR398、miR5287等,和低磷诱导下调的miR156、miR160、miR169、miR171、miR2643、miR396等。4.利用psRNATarget、TargetFinder和Tapirhybrid软件综合预测到909个差异表达的miRNA靶基因,主要包括参与生长发育的转录因子(MYB、AP2、GRAS、CCAAT和MADS等)和生长调节因子,参与根发育的生长素应答因子,多种抗逆保护蛋白以及磷转运蛋白等。RLM-RACE结果证明miR156、miR160a、miR160c、miR166和miR396作用的靶基因位点与预测结果一致。靶基因GO和KEGG富集结果主要包括信号传导,糖类、脂肪、氨基酸基本代谢过程,激素刺激响应、化学刺激响应和生长素调控通路等。根据苜蓿在低磷下生理与形态的响应和差异表达的miRNAs及靶基因,miRNAs主要参与的苜蓿低磷应激调控有:(1)氨基酸、糖类、脂肪酸等基础代谢响应;(2)具有普遍抗逆保护蛋白形成的应激响应;(3)根系的生长发育;(4)磷转运蛋白的调控和有机酸的分泌等低磷特异响应。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S541.9
【图文】：

密度分布图,中国土壤,有效磷,密度分布图

对于有效磷密度而言，东部沿海地区和青藏高原地区要低于其他地区（汪涛等，2008）（图1.1）。图 1.1 中国土壤有效磷密度分布图（汪涛等，2008）Fig. 1.1 Spatial pattern of available phosphorus density in China植物主要以 HPO42-和 H2PO4-的形式从土壤中获取磷素，施入土壤的磷肥中的磷与某些金属离子及土壤黏粒通过吸附固定、沉淀或微生物吸收作用形成铁磷、铝磷、锰磷、钙磷和镁磷等难溶性盐，而 PO43-不易被吸收植物根系吸收利用，使土壤成为无效的“天然磷库”，在降水和灌溉作

土壤有效磷,低磷胁迫,磷酸酶,有机酸

图 1.2 植物适应较低土壤有效磷策略注：低磷胁迫下植物通过根分泌有机酸、磷酸酶提高土壤有效磷，以及结合丛枝菌根真菌辅助磷的吸收，根系的生长发育受基因、糖和激素的调控。Fig. 1.2 Plant strategies to enhance phosphate (Pi) availability in the soilNote: The production and secretion of organic acids (OAs) and phosphatases as well as the arbuscular mycorrhizal (AM)associations with the root system of bean, for example, enhance Pi availability in the soil and P uptake by roots. Inaddition, the development of a highly branched root system, controlled by several genes, sugar, and hormones, enhancesthese root traits (Lopez-Arredondo et al., 2014).1.1.1 根系结构对低磷的适应机制植物主要通过向地性变化和根冠之间的能量分配来改变根构型，低磷环境下，建立较为理想的根构型是确保在消耗较少碳源的前提下吸收磷的重要手段（Lynch, 2011; Lopez-Arredondo et al.,2014），如菜豆“深根吸水，浅根吸磷”的伞状根构型是磷吸收的理想根构型（廖红和严小龙，2000）。目前已经对多种植物包括拟南芥、玉米、水稻、马铃薯和菜豆在低磷胁迫下根系构型进行了解剖，表现为低磷促进侧根原基的分化、主根及侧根的生长、侧根角度的调整以及调整根毛的密度和延伸（Lopez-Bucio et al., 2002; Lopez-Bucio et al., 2003）。研究发现根构型变化受激素（生

作用过程,植物,细胞质

中国农业科学院博士学位论文第一章引言DEGRADING NUCLEASE (SDN)降解，由于 HENI 的甲基化作用对 dsRNA 具有偏好性，暗示HEN1对于miRNA的甲基化是发生在miRNA和miRNA*双链分离之前（赵猛，2014；Yu et al., 2005;Yang et al., 2006b）（图 1.4-A）。植物 pre-miRNA 或成熟的 miRNA由DCL1 加工并由HASTY（HST）（一种与 exportin 5（EXP5）同源的输出蛋白）转运到细胞质，一般 pre-miRNA 在植物体内出现的时间特别短，可能是 HST 很快地将 miRNA/miRNA*或单链 miRNA 运出，大家也普遍认为最终的 miRNA 成熟也发生于细胞质（Ha and Kim, 2014）（图 1.4-B）。在细胞质中，miRNA 被装载到细胞质 ARGONAUTE（AGO）蛋白上，其中 AGO1 是 miRNA途径的主要参与者（Jones-Rhoades et al., 2006; Chen, 2009; Voinnet, 2009; Ha and Tran, 2014）。另一方面，miRNA 装载到沉默复合体可保护其免受降解，而 miRNA*被降解掉（Jones-Rhoades et al.,2006）。其中 miRNA 结合到诱导的基因沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC），形成非对称 RISC 复合物，进一步引导沉默复合体（RISC）降解 mRNA 或阻碍其翻译。非对称 RISC装载源于 siRNA 5′末端的稳定性，5′末端稳定性差的 siRNA 则会被装载到 RISC 复合体，例如miRNA5′末端稳定性要差于相对应的 miRNA*的稳定性（Schwarz et al., 2003）（图 1.4-C）。

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