水稻染色体结构维持蛋白SMC1及SMC3在DSB修复中的功能研究

发布时间：2020-07-15 01:52

【摘要】：染色体结构维持(structural maintenance of chromosome,SMC)蛋白在维持染色体形态特征结构中有主要作用。真核生物中有6种SMC同源蛋白:SMC1-6。SMC蛋白主要以复合体的形式发挥功能。SMC蛋白两两形成异二聚体(SMC1与SMC3,SMC2与SMC4,SMC5与SMC6),再分别结合其他非SMC蛋白成分形成三种SMC蛋白复合体(凝聚蛋白、黏结蛋白和SMC5-SMC6复合体)。DNA双链断裂(double-strandbreak,DSB)是一种危害性很高的损伤形式。DSB可以发生于DNA复制期,或者暴露在造成DNA损伤的因素下。DSB的正确修复是细胞存活以及基因组稳定性的基础。真核生物细胞主要有两种DSB修复机制:非同源末端连接(non-homologous end-joining,NHEJ)和同源重组(homologous recombination,HR)。根据修复过程中链侵入是否需要由RAD51重组酶的催化,同源重组修复又可以细分为两种类型:需要 RAD51 重组酶的 synthesis-dependent strand annealing(SDSA)途径以及不依赖RAD51重组酶的single-strand annealing(SSA)途径。在酵母以及拟南芥中的研究表明,SMC1和SMC3蛋白参与DSB的修复,但是具体作用机制尚不明确。而在水稻中,它们在DSB修复中的作用还没有进行系统研究。在本研究中,我们对水稻中SMC1以及SMC3基因的功能做了初步的探索,具体结果如下:1、成功构建了SMC1、SMC3-1、SMC3-2和SMC3-基因的 CRISPR/Cas9 编辑载体,获得了相应的转基因植株,并通过自交的方法获得纯合的突变体株系。2、通过对水稻各组织中SMC1、SMC3-1、SMC3-2和SMC3-3基因表达量进行Real-time PCR 分析,结果显示 SMC1 和 SMC3-1 在水稻幼穗中 的表达量最高,而 SMC3-2和SMC3-3在叶片中有较高表达。3、SMC1和SMC3-1基因强突变类型的杂合体后代中不能获得纯合突变体,我们推测SMC1和SMC3-1基因强突变导致水稻胚胎致死。4、突变体以及野生型植株根尖的丝裂霉素敏感性实验表明,smc1和smc3-3突变体相较于野生型对丝裂霉素敏感,水稻中可能是SMC1和SMC3-3基因对姐妹染色单体之间的黏着更重要。5、博莱霉素敏感性实验表明,smc1和smc3-2突变体相较于野生型对博来霉素敏感,表明SMC1和SMC3-2能够参与DSB修复。6、γ射线照射以及博来霉素处理后Real-time PCR的结果显示,smc1、smc3-2和smc3-3突变体中HR和NHEJ修复路径中相关基因的表达量相较于野生型有显著变化,表明SMC1和SMC3可以通过HR或NHEJ路径影响DSB的修复。7、根尖蛋白免疫结果发现smc3-3中RAD51A2蛋白信号的募集相比较于野生型有显著减少,表明SMC3-3通过SDSA修复路径参与DSB修复。8、我们通过适用于水稻体细胞重组修复率的检测体系,对各个突变体进行分析,结果发现SMC1、SMC3-2、和SMC3-3基因的突变会造成体细胞SSA重组修复率的降低,而只在smc3-3突变体中发现SDSA修复路径受到影响。即:SMC1和SMC3-2参与SSA重组修复过程,SMC3-3同时参与SSA和SDSA重组修复过程。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S511
【图文】：

ＳＭＣ蛋白Ｒａｄ２１／Ｓｃｃｌ和Ｓｃｃ３／ＳＡ构成，ＳＡ蛋白在脊椎动物体细胞中又分为ＳＡ１以及ＳＡ２逡逑两类。其中两个ＳＭＣ蛋白形成一个反向二聚体，该二聚体的起始域与Ｒａｄ２１蛋白互作，逡逑完成封闭环结构，Ｒａｄ２１再与ＳＡ结合，从而形成了完整的黏结蛋白复合体［２％邋（图１．２）。逡逑黏结蛋白复合体参与姐妹染色单体的黏着、ＤＮＡ修复以及细胞周期中检查点（ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）逡逑的活化。逡逑黏结蛋白在Ｇ１期加载到染色质上，Ｓｃｃ２和Ｓｃｃ４组成的蛋白复合体作为加载因子。在逡逑Ｓ期参与姐妹染色单体的黏着，对Ｍ期染色体的正确分离也有重要的作用＾］。黏结蛋白黏逡逑着力的形成需要激活“形成因子’’（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ邋ｆａｃｔｏｒ）Ｅｃｏｌ。绝大多数的黏结蛋白、相关蛋逡逑白（Ｗａｐｌ，Ｐｄｓ５等）以及加载因子（Ｓｃｃ２／ＳＣＣ４）都在细胞分裂前期时从染色体臂上被移除，逡逑其余附着在着丝粒上的黏结蛋白蛋白在后期被去除。黏结蛋白复合体可以有效防止姐妹染逡逑色单体的提前分离，因而在维持染色体稳定性方面具有重要的意义。黏结蛋白在细胞分裂逡逑过程中的机制尚不明了，但普遍认为其功能的发挥依赖于多个相关蛋白的协调作用。逡逑目前，关于黏结蛋白维持染色质稳定的机制主要有以下３种模型：单环模型（ｏｎｅｒｉｎｇ逡逑ｍｏｄｅｌ）、双环模型（ｔｗｏ邋ｒｉｎｇ邋ｍｏｄｅｌ）以及多杆状模型（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ邋ｒｏｄ－ｓｈａｐｅｄ邋ｍｏｄｅｌ）［川。逡逑单环模型认为：黏结蛋白将两个ｌ0ｎｍ长的姐妹染色单体纤维捕获在一个三角形的环形结逡逑构中。双环模型提出：一个黏结蛋白环绕一条姐妹染色单体

逦ＣｏＵｅｄ－ｃｏｉｌ逦Ｃ－ｔｅｎｎｉｎａｌ逡逑图１．１邋ＳＭＣ蛋白的基本结构逡逑Ｆｉｇｌ．ｌ邋Ｔｈｅ邋ｂａｓｉｃ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＳＭＣ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑１．３逦黏结蛋白的生物学特征与功能逡逑黏结蛋白复合体最早发现于酵母细胞。该蛋白复合体含有４个亚基：即一对染色体结逡逑构维持蛋白（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ邋Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ邋ｏｆ邋Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ，邋ＳＭＣ）邋ＳＭＣ１邋和邋ＳＭＣ３，以及两个非逡逑ＳＭＣ蛋白Ｒａｄ２１／Ｓｃｃｌ和Ｓｃｃ３／ＳＡ构成，ＳＡ蛋白在脊椎动物体细胞中又分为ＳＡ１以及ＳＡ２逡逑两类。其中两个ＳＭＣ蛋白形成一个反向二聚体，该二聚体的起始域与Ｒａｄ２１蛋白互作，逡逑完成封闭环结构，Ｒａｄ２１再与ＳＡ结合，从而形成了完整的黏结蛋白复合体［２％邋（图１．２）。逡逑黏结蛋白复合体参与姐妹染色单体的黏着、ＤＮＡ修复以及细胞周期中检查点（ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）逡逑的活化。逡逑黏结蛋白在Ｇ１期加载到染色质上，Ｓｃｃ２和Ｓｃｃ４组成的蛋白复合体作为加载因子。在逡逑Ｓ期参与姐妹染色单体的黏着，对Ｍ期染色体的正确分离也有重要的作用＾］。黏结蛋白黏逡逑着力的形成需要激活“形成因子’’（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ邋ｆａｃｔｏｒ）Ｅｃｏｌ。绝大多数的黏结蛋白、相关蛋逡逑白（Ｗａｐｌ，Ｐｄｓ５等）以及加载因子（Ｓｃｃ２／ＳＣＣ４）都在细胞分裂前期时从染色体臂上被移除，逡逑其余附着在着丝粒上的黏结蛋白蛋白在后期被去除。黏结蛋白复合体可以有效防止姐妹染逡逑色单体的提前分离

ｉ、、、、？／＿逡逑ＳＡ１／２逦＇逡逑图１．２黏结蛋白结构示意图（根据参考文献［２９】修改）逡逑Ｆｉｇｌ．２邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｃｏｈｅｓｉｎ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋（ｍｏｄｉｆｉｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ邋［２９］）逡逑Ｉ．

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本文编号：2755794