基于cpDNA分子标记的三七居群遗传多样性研究

发布时间：2020-07-16 19:05

【摘要】：本研究基于已发表的三七(Panax notoginseng)叶绿体基因组,开发分子标记,对9个三七栽培居群,共计89份样本进行遗传多样性分析。9个取样地分别为:文山市、砚山县、麻栗坡县、马关县、丘北县、广南县、建水县与蒙自县。DNA从三年生三七新鲜叶片提取,提取方法为CTAB法与试剂盒法。本研究所用分子标记由cpSSR(chloroplast simple sequence repeat)、cpDNA(chloroplast deoxyribonucleic acid)多态性位点与matK基因三种类型组成。通过搜索三七cpDNA,获得90个cpSSRs,引物设计成功的有7对(cpSSR-1~7),6对可扩增条带,引物cpSSR-5凝胶结果显示明显条带差异性。cpSSR以三碱基重复类型为主,占比70~71%;二碱基重复最少,占比7%。比较cpSSR分布位置,分布于基因区的cpSSR占比高于基因间区。基于重复单元的类型与重复次数差异,确定研究重点区域为:psbJ-psbL、rpl14-rpl16和ycf1。基于三七不同cpDNA序列比对结果,共获得30个多态性位点(14个In Dels与16个SNPs),获得11对引物。多态性位点在基因间区的分布高于基因区,这与cpSSR的分布相反。根据基因区或基因间区含有多态性位点数目,确定研究重点区域为:trnH(GUG)-psbA、psbM-trnD(GUC)、rpl14-rpl16、atpF-atpH、psbZ与ycf1。这与cpSSR确定研究重点区域rpl14-rpl16和ycf1重叠,将作为本研究重点分析区域。根据DNA凝胶电泳的结果区分度,本研究将重点放在cpInDel(chloroplast insertion-deletion);并确定引物pgcp019与pncp08可用于三七栽培居群的区分。本研究重点是基于三七cpDNA多态性位点开发分子标记。在确定的多态性位点中,不包含matK基因,考虑到matK基因是常用分子标记,设计matK基因作为对照(验证本研究确定多态性位点是否可靠)。matK基因凝胶电泳结果并未观察到明显的条带差异性,考虑到凝胶电泳的区分度(SNP与InDels小于5 bp难以观测),需要通过测序进一步验证。ycf1基因作为重点研究区域,亦作为matK基因对照之一。ycf1基因从凝胶结果明显可见差异性,但存在非特异性条带,未对其进一步研究。本研究确定对cpSSR-5、pgcp019、pncp08与pncp-M(matK基因引物)四对引物扩增结果测序。基于测序结果,引物cpSSR-5确定2种SNP单倍型与10种InDel单倍型,可区分4个栽培居群;引物pgcp019划定SNP与In Del的单倍型种类分别为5与7,可区分5个栽培居群;引物pncp08获得4种In Del单倍型,可区分2个栽培居群;引物pncp-M划分SNP单倍型9种,InDel单倍型14种,可区分居群数为6。基于本研究结果,引物pgcp019与matK基因都具有一定程度的区分居群效果。这说明本研究确定多态性区域,具有一定的参考价值。基于引物pgcp019与matK基因测序结果,构建NJ系统进化树,分别聚为4个与6个类群。从划定的类群与单倍型种类出发,引物pncp-M的区分效果优于引物pgcp019。但综合考虑(综合序列长度、群体π值和平均核苷酸差异数等指标)表明引物pgcp019区分居群效果优于matK基因。基于四对引物测序结果,采用SNP与InDel分别获得单倍型,通过组合,得到39种组合单倍型。根据居群内特有组合单倍型,可区分9个栽培居群。基于居群内组合单倍型数目,确定居群3(麻栗坡县)的遗传多样性最高。
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S567.236;Q943.2
【图文】：

DNA提取结果（部分）

碱基,类型,重复单元,出现次数

图Fig. 3颜色代表不同三七叶绿体型的 cpSSR 在四个A 占比不同；其中同三七 cpSSR cpSSR 重复单元与出现次数，横坐标表示该类型重复单元在其中不同颜色代表不同基因组“T”出现次数都为 8 个；出现次数位居第二的是一致（6 个）。单碱基3.1 cpSSR 碱基类型所占比例3.1 The rate of different types of cpSSR颜色代表不同三七叶绿体 cpDNA，分别以 KJ、KP、KR 与 KTcpDNA 的占比相同，单碱基与三碱基重复类型其中，三碱基重复类型的占比最大，二碱基重复的占差异分析重复单元与出现次数进行统计。纵坐标代表 cpSSR横坐标表示该类型重复单元在不同叶绿体基因组出现次不同颜色代表不同基因组。在所有类型重复单元中出现次数最多，除在 KT 叶绿体基因组中为 7 个出现次数位居第二的是“TAA”重复，在四个叶。重复单元在不同 cpDNA 出现次数存在差异二碱基三碱基四碱基代表单碱基与三碱基重复类型二碱基重复的占叶绿体基因组出现次重复单元中：个，在在四个叶差异

条图,PCR扩增,引物,差异性

图 3.4 cpSSR 的 PCR 扩增结果（部分）Fig. 3.4 The result of cpSSR PCR (part)（a），引物 cpSSR-5 扩增结果，63℃，25s；（b），引物 cpSSR-6 扩增结果条件与（a）一致；（c），cpSSR-7 扩增结果，无条带；（d），60℃，30s 条件下，cpSSR-1~6 扩增结果，对应编号分别为，1、2，3，4、5，6，7、8，9。3.4.4 cpSSR 引物筛选结果使用经过筛选的 6 对 cpSSR 引物，在确定两种 PCR 反应条件下（60℃，30s；℃，25s），对 89 个样品 PCR 扩增。从条带差异性来看，与 cpSSR 差异性预计果相似，6 对引物中有 5 对引物条带无差异性。唯一具有条带差异性的为引物SSR-5，编号 31-40，为样地 4 的样品，白色箭头标注 34 号样品显示差异性条图3.5a）；编号 81-90 取自样地 9，其中，84 号样品具有差异性条带（图 3.5b）。外，通过本实验空白对照组，证明反应体系没有污染。引物 cpSSR-5：位于基因间区 rps15-ycf1，重复单元为 CTC-3/ATT-3，预计片

【参考文献】