丹参miRNA对连作障碍的响应及其在次生代谢调控中的作用研究
发布时间：2020-07-17 01:27
【摘要】：丹参连作障碍已成为制约药用植物丹参生产的一大因素,丹参连作障碍不仅影响丹参的产量,而且降低丹参主要药用成分丹酚酸B和丹参酮的含量。miRNA是一类非编码小分子RNA,主要通过与靶基因互作,在转录后水平负调控靶基因的表达。为了从miRNA角度探讨丹参miRNA在丹参连作障碍及次生代谢合成调控中的作用,本研究通过miRNA高通量测序技术及分子生物学实验技术,对响应丹参连作的miRNA进行系统分析,进而利用转基因技术验证miR164a对化感自毒物质的耐受性及其在丹参次生代谢合成中的作用展开深入地分析,取得如下主要结果:(1)通过高通量测序获得了丹参连作和非连作两个miRNA库,第一年种植丹参根miRNAs(FPR)和连作丹参根miRNAs(SPR)。从两个库中鉴定了110条已知的miRNAs和7条新的miRNAs,其中39条已知的和两条新的miRNA在两个库中差异表达,通过生物信息学软件和降解组数据分析它们的靶基因,并经qRT-PCR对这些差异miRNA及靶基因进行进一步分析。同时对第一年种植和连作丹参的丹酚酸和丹参酮含量进行测定,最终确定了miR160a和miR164a极可能参与了丹参连作障碍的应答以及对丹参酚酸和丹参酮的调控。(2)为了验证miR164a在丹参中的生物学功能及作用机制,我们构建了miR164a的过表达载体并获得了miR164a过表达转基因毛状根,用终浓度为5-100μg/mL的对羟基肉桂酸(模拟连作障碍中的化感物质)处理,与野生型毛状根相比,miR164a过表达转基因植株对对羟基肉桂酸具有显著的耐受性。此外,我们还发现,miR164a过表达的毛状根中生物量仅为野生型的32.43-47.84%;丹参酮IIA(T-IIA)的含量也降为野生型的53%-66%。但是丹酚酸B的含量在过表达毛状根中明显高于野生型。这些结果表明miR164a可能通过负调控SmNAC2和SmNAC3,促进植物对连作障碍的抗性及丹酚酸B的合成。(3)利用psRNAtarget预测miR164a的靶基因为SmNAC2和SmNAC3,通过遗传转化方法分别获得了SmNAC2和SmNAC3的过表达(OE-NAC2和OE-NAC3)及沉默表达(RNAi-NAC2和RNAi-NAC3)转基因丹参毛状根,与野生型相比,OE-SmNAC2-1,2两个株系中丹参酮Ⅰ(T-Ⅰ)分别下降到野生型的59.31%和52.68%,T-ⅡA含量下降到65.4%和59.28%,丹酚酸B含量没有明显变化;而RNAi-NAC2-1和RNAi-NAC2-2的T-Ⅰ分别增加为野生型的4.22和3.14倍,T-ⅡA分别增加为野生型的3.10和5.09倍,丹酚酸B含量增加了2.43和3.21倍。OE-SmNAC3转基因毛状根中OE-NAC3-2和OE-NAC2-3的T-Ⅰ分别增加为野生型的5.68和5.11倍,T-ⅡA分别增加为野生型的10.03和7.54倍,而丹酚酸B的含量降低到54.5%和75.26%;RNAi-NAC3-1和RNAi-NAC3-2的T-Ⅰ则分别降低为野生型的24.56%和23.34%,T-ⅡA为野生型的46.15%和30.5%,而丹酚酸B的含量增加了1.47和1.25倍。以上结果显示SmNAC3对T-ⅡA正调控而对丹酚酸B是负调控根据miRNA对靶基因的负调控原理,由于miR164a对丹酚酸B是正调控而对T-IIA是负调控,它的靶基因应该对T-ⅡA正调控而对丹酚酸B是负调控,因此SmNAC3可能在miR164a的两个靶基因中发挥着主要作用。(4)为了验证miR160a在丹参酮、丹酚酸合成通路中的调控作用,构建了miR160a的过表达载体并获得了miR160a过表达转基因毛状根。与野生型毛状根相比,miR160a过表达转基因毛状根生物量显著增加,是野生型的1.5-1.9倍;丹参酮含量显著降低,甚至有的株系未检测到丹参酮,丹参酮合成通路关键酶基因的表达也被显著抑制;而丹酚酸B的含量增加了1.3-1.9倍。进一步检测生长素(Indoleacetic acid,IAA)、茉莉酸(Jasmonic acid,JA)和水杨酸(Alicylic acid,SA)含量,结果显示,过表达转基因毛状根中IAA含量增加,而JA和SA含量降低,推测miR160a也许通过影响植物激素含量而负调控了丹参酮的生物合成。综上所述,本研究通过高通量测序技术分析了丹参连作和非连作下miRNA的表达谱,并对筛选出的响应连作障碍的miRNAs进行了深入系统的分析,验证了miR164a及其靶基因和miR160a可能的生物学功能及其作用机制,研究结果为进一步研究丹参的miRNA的生物学功能提供基础数据,为进一步阐明丹参连作障碍和次生代谢物合成调控机制提供重要线索。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S567.53
【图文】：
物中 miRNA 概述iRNA是生物体内普遍存在的内源、非编码小分子RNA，它的前体具有发 et al.2004;Ambros et al.2003)。miRNA长度约16~29 nt，平均22 nt，大部分ng et al. 2009)。miRNA是一类负调控因子，主要通过转录后水平调控基因与靶基因几乎完全互补降解靶基因mRNA，或与靶基因mRNA不完全配对翻译(Lai et al.2003;Baohong et al.2006)。物中 miRNA 的生源合成途径与植物不同，动物 miRNA 在聚合酶Ⅱ作用初级miRNA(pri-miRNA)，然后被一种称为Drosha的RNA酶Ⅲ及辅助因环结构的前体 pre-miRNA。植物中没有 Drosha 同源类似物，这个过程是在L1 作用下完成的(Millar et al.2005; Olivier 2009;秦彤 等 2011)。Pre-min-5 作用下进入细胞质，然后被 Dicer 切割，pre-miRNA 的环状结构被切iRNA/miRNA*杂合双链分子。双链体分子与 RNA 诱导的沉默复合物中，miRNA*链解离，另一条与 AGO 蛋白结合称为成熟单链 miRNA(Kashilliam et al.2010;Olivier 2009)。图 1-1 为植物 miRNA 生源合成途径。
CYP98A78（CYP98A14的等位基因变异型）作为特定的羟化酶催化4-香豆酰-3', 4'-二羟基-苯乳酸生成迷迭香酸(Chen et al. 2014; Di et al. 2013, 2017a)。目前从迷迭香酸到丹酚酸B及丹参素的合成路径还不清楚，也是目前丹酚酸生物合成路径中的瓶颈难题。图1-2显示了丹参中迷迭香酸生物合成途径及从迷迭香酸到丹酚酸B的可能途径。丹参酮的生物合成途径主要包括细胞质中的甲羟戊酸途径（mevalonate，MVA）和质 体 中 的 非 甲 羟 戊 酸 途 径 （ 2-C-methyl-d-erythritol-4-phosphate ， MEP ） (Ma etal.2015;Vranová et al.2013;Cheng et al.2013)（图 1-3）。很多丹参酮生物合成相关基因，如 HMGR、DXS、DXR、GGPPS、FPPS、IPPI、CPS 和 KSL，已被国内外学者成功克隆并采用转基因的手段研究了它们在丹参酮合成路径中的作用(Cui et al.2011;李滢 等2010a;Hua et al.2011;Yang et al.2013; Dai et al.2011;Gao et al.2009)。近些年来，丹参毛状根已经成为研究丹参酮和丹酚酸生物合成与调控的一种方便有效的材料(Hu et al.1993;Wang et al.2010;Jian et al.2010)。人们采用多种诱导子诱导丹参毛状根中丹参酮和丹酚酸的积累，如生物诱导子，重金属离子（Co2+,Ce，Ag+,Cd2+）(Zhang et al.2004; Ge et al. 2005; Zhao et al. 2010; Xing et al. 2014; 韩名宇 等 2015) 和植物激素类物质（脱落酸和茉莉酸甲酯）等(Zhao et al.2010;Chen et al. 1999; Liang et al.2012 ;Yang et al. 2012 ;Huang et al.2017)
图 1-3 丹参酮生物合成途径(李滢等 2010)Figure 1-3 Biosynthetic pathway of tanshinone究的目的与意义传统中药材，丹参中主要有效成分是丹酚酸B和丹参酮一。丹参连作障碍不仅导致丹参产量下降，而且严重的活性成分含量降低。见植物如拟南芥、烟草和水稻等miRNA研究的扩大和究也迅速展开，在半夏、人参、地黄和红豆杉等药用生物信息学手段对其功能做了预测，一些miRNA除了胁迫外，还参与了药用植物次生代谢的调控。但是对不是很深入，药用植物中miRNA的生物学功能研究也究仅限于描述性质的，即miRNAs的发现及靶基因的用机制。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S567.53
【图文】：
物中 miRNA 概述iRNA是生物体内普遍存在的内源、非编码小分子RNA，它的前体具有发 et al.2004;Ambros et al.2003)。miRNA长度约16~29 nt，平均22 nt，大部分ng et al. 2009)。miRNA是一类负调控因子，主要通过转录后水平调控基因与靶基因几乎完全互补降解靶基因mRNA，或与靶基因mRNA不完全配对翻译(Lai et al.2003;Baohong et al.2006)。物中 miRNA 的生源合成途径与植物不同，动物 miRNA 在聚合酶Ⅱ作用初级miRNA(pri-miRNA)，然后被一种称为Drosha的RNA酶Ⅲ及辅助因环结构的前体 pre-miRNA。植物中没有 Drosha 同源类似物，这个过程是在L1 作用下完成的(Millar et al.2005; Olivier 2009;秦彤 等 2011)。Pre-min-5 作用下进入细胞质，然后被 Dicer 切割，pre-miRNA 的环状结构被切iRNA/miRNA*杂合双链分子。双链体分子与 RNA 诱导的沉默复合物中，miRNA*链解离，另一条与 AGO 蛋白结合称为成熟单链 miRNA(Kashilliam et al.2010;Olivier 2009)。图 1-1 为植物 miRNA 生源合成途径。
CYP98A78（CYP98A14的等位基因变异型）作为特定的羟化酶催化4-香豆酰-3', 4'-二羟基-苯乳酸生成迷迭香酸(Chen et al. 2014; Di et al. 2013, 2017a)。目前从迷迭香酸到丹酚酸B及丹参素的合成路径还不清楚，也是目前丹酚酸生物合成路径中的瓶颈难题。图1-2显示了丹参中迷迭香酸生物合成途径及从迷迭香酸到丹酚酸B的可能途径。丹参酮的生物合成途径主要包括细胞质中的甲羟戊酸途径（mevalonate，MVA）和质 体 中 的 非 甲 羟 戊 酸 途 径 （ 2-C-methyl-d-erythritol-4-phosphate ， MEP ） (Ma etal.2015;Vranová et al.2013;Cheng et al.2013)（图 1-3）。很多丹参酮生物合成相关基因，如 HMGR、DXS、DXR、GGPPS、FPPS、IPPI、CPS 和 KSL，已被国内外学者成功克隆并采用转基因的手段研究了它们在丹参酮合成路径中的作用(Cui et al.2011;李滢 等2010a;Hua et al.2011;Yang et al.2013; Dai et al.2011;Gao et al.2009)。近些年来，丹参毛状根已经成为研究丹参酮和丹酚酸生物合成与调控的一种方便有效的材料(Hu et al.1993;Wang et al.2010;Jian et al.2010)。人们采用多种诱导子诱导丹参毛状根中丹参酮和丹酚酸的积累，如生物诱导子，重金属离子（Co2+,Ce，Ag+,Cd2+）(Zhang et al.2004; Ge et al. 2005; Zhao et al. 2010; Xing et al. 2014; 韩名宇 等 2015) 和植物激素类物质（脱落酸和茉莉酸甲酯）等(Zhao et al.2010;Chen et al. 1999; Liang et al.2012 ;Yang et al. 2012 ;Huang et al.2017)
图 1-3 丹参酮生物合成途径(李滢等 2010)Figure 1-3 Biosynthetic pathway of tanshinone究的目的与意义传统中药材，丹参中主要有效成分是丹酚酸B和丹参酮一。丹参连作障碍不仅导致丹参产量下降，而且严重的活性成分含量降低。见植物如拟南芥、烟草和水稻等miRNA研究的扩大和究也迅速展开，在半夏、人参、地黄和红豆杉等药用生物信息学手段对其功能做了预测，一些miRNA除了胁迫外，还参与了药用植物次生代谢的调控。但是对不是很深入，药用植物中miRNA的生物学功能研究也究仅限于描述性质的，即miRNAs的发现及靶基因的用机制。
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3 王sニ
本文编号：2758792
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