广藿香倍半萜合成通路关键酶基因鉴定和PatFPPS的功能分析

发布时间：2020-07-24 16:13

【摘要】：广藿香(Pogostemon cablin(Blanco)Benth)是一种重要的岭南中药材和工业作物,富含广藿香挥发油,包含多达24种倍半萜特异化合物,其中含量最高的是具有显著生物活性的广藿香醇。广藿香醇属于三环倍半萜化合物,其生物合成来源于经典的MVA途径和MEP途径。为解析广藿香倍半萜生物合成途径,我们利用综合分析的方法对基因的序列结构、同源性、保守结构域特性、亚细胞定位、系统发育、表达模式和功能表征进行分析。研究了PatFPPS的表达模式、亚细胞定位和功能,并对PatFPPS基因同源表达和异源表达进行研究,以期为广藿香醇的代谢工程提供更多可能的调控靶点。本论文主要研究结果包括以下几点:1.基于转录组对广藿香倍半萜合成途径关键酶进行分析首次在广藿香转录组中鉴别出78条与萜类物质合成相关的基因,其中参与到MVA、MEP和萜类物质下游途径的基因数量分别为28条、38条和12条。分析了这些基因在广藿香花、茎和叶片中的转录水平,发现这些基因在不同组织中均有表达,其中MVA途径关键酶主要在花中的表达,MEP关键酶基因在叶片中的表达水平最高,下游关键酶基因在花和叶片中的表达水平相对较高。基于转录组测序结果,分析了这些基因的基本序列结构,发现几乎所有的基因都具有相应的结构域,利于后续对萜类合成途径关键酶进一步研究。2.广藿香倍半萜合成途径关键酶的克隆与表征基于转录组分析,筛选表达量相对较高且具有完整的CDS的基因进行克隆,得到 MVA 途径酶基因(PatDXS、PatDXR、PatMCT、tCMK、PatMDS、PatHDS和PatHDR)、MEP 途径酶基因(PatAACT、PatHMGS、PatHMGR、PatMVK、PatPMK和PatMVD)和下游途径关键酶(PatIPPI和PatFPPS)。利用生物信息学分析这些基因的序列结构、同源性、保守域、亚细胞定位和系统发育。利用大肠杆菌颜色互补实验验证了 MEP通路蛋白的功能活性。荧光定量PCR分析表明,MVA途径基因(PatAACT、PatHMGR、PatMVD和PatFPPS)参与由MeJA介导广藿香醇的生物合成。这些结果为利用萜类基因工程提高广藿香醇含量提供了有益的信息。3.PatFPPS的分子鉴定与亚细胞定位研究本论文首次从广藿香中分离出PatFPPS基因,cDNA全长为1050 bp,具有典型的保守结构域,与其他植物物种的FPPS具有高度同源性。通过qRT-PCR对PatFPPS的表达模式进行分析,发现PatFPPS具有组织特异性,并且受到MeJA、ABA、ETH和SA植物激素的诱导。将PatFPPS分别与GFP的N端和C端融合进行定位实验,结果显示PatFPPS定位于细胞质,而不是过氧化物酶体,符合生物信息学预测。4.广藿香PatFPPS调控萜烯和广藿香醇的生物合成在FPS缺陷菌株中PatFPPS的功能互补实验,证明PatFPPS具有生物活性,介导法呢基二磷酸的生物合成。构建植物瞬时过表达载体研究PatFPPS在广藿香植株中的功能。通过GUS组织化学染色证实了表达载体构建成功并且能在广藿香叶片中表达。通过GC-MS分析发现过表达株系中广藿香醇含量高达2.16 mg/g,比对照植株增加了 0.5倍左右,说明PatFPPS可以催化代谢流往广藿香醇生物合成的方向流动,促进广藿香醇的积累。为了深入研究PatFPPS在萜类代谢中的作用以及对萜烯产物的影响,我们获得了 26株阳性转PatFPPS基因烟草。通过普通PCR扩增与qRT-PCR证实PatFPPS基因在转基因植物的叶片中表达,并且qRT-PCR结果显示PatFPPS表达水平比对照比高5-15倍。ELISA实验显示,转基因烟草中FPPS酶活性显著上调。挥发性萜类测定结果表明转基因烟草中的豆甾醇、植物醇和新植物二烯含量显著升高,这与在PatFPPS过表达植株中观察到的基因表达和FPPS酶活性变化一致,说明PatFPPS是广藿香醇合成途径关键酶并且促进萜烯类化合物的生物合成。5.PatFPPS启动子分离与互作蛋白的筛选利用FPNI-PCR分离PatFPPS启动子,得到一段长度为724 bp的启动子,利用生物信息学软件分析,发现该启动子具有真核生物启动子必需的核心元件(TATA-box)外,还含有ERE(乙烯响应元件)、ABRE(脱落酸响应元件)、光响应元件、BOX-W1(真菌胁迫)、AT-rich element(AT-rich的DNA与蛋白结合位点)等顺式作用元件。通过酵母单杂交实验筛选到若干可能参与PatFPPS启动子互作并调控其表达的基因。
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S567.239
【图文】：

广藿香,倍半萜,关键酶,途径

为了鉴定在广藿香中涉及倍半萜生物合成的基因及其时空表达，基于我们的转录逡逑组数据研究了叶、茎和花中７４种新的倍半萜生物合成相关基因的转录特征和表达丰逡逑度（图１－１）。这些基因属于１５个基因家族，它们编码ＭＶＡ途径和ＭＥＰ途径中参与逡逑基本异戊二烯前体ＩＰＰ及其异构体ＤＭＡＰＰ生物合成的所有酶，以及法尼基焦磷酸合逡逑酶。这７４个基因的序列长度范围为８０４至３３４３邋ｂｐ，平均ｍＲＮＡ长度为１９７２ｂｐ。大逡逑多数转录本都被Ｎｒ、ＫＥＧＧ、ＧＯ和ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ数据库充分注释。我们发现ＭＶＡ途径逡逑关键酶基因在花中表现出最高的表达水平，而ＭＥＰ途径关键酶基因在叶中表现出最逡逑１２逡逑

酶基因,硫解酶,转录组,重复基因

逦广州中医药大学２０１９届硕士学位论文逦逡逑转录组中鉴定了八个ＡＡＣＴ基因（Ｐｆｌ／Ａ４ＣＴｌ－Ｐｏ＾Ｌ４Ｃ：Ｔ８）（表Ｓ２）。基因表达谱显示逡逑兄４ＣＴ１－／＾／义４Ｃｒ８在所有组织中都有表达，并且主要在叶中高度表达（图１－１）。逡逑／＾ＭｊＣ；Ｔ６在叶片中的表达水平最低，可能是因为它缺乏完整的保守的硫解酶结构域逡逑（图１－２）。化／NB４ＣＴ１和具有非常高的序列相似性并且显示出相似的表达逡逑水平，表明它们可能是广藿香中的重复基因。逡逑ＡＡ（ＴＩ邋？—？？？？■．■■■■■■邋＇—．ＰＭＫ１逦ｍｍ＊逦＊＊＊逦ＨＩＩＳＩ逦＿闺丨＊，伽＊ｌｕ＿丨■…＂}0晒？■刚命＿｜＿晒＿邋．逡逑

系统进化树,丹参

ＸＲ催化ＤＸＰ向ＭＥＰ的分子内重排和还原。在广蕾香转录组数据中仅发现一逡逑Ｒ基因（八ｙ／ＤＡＴ？），其推测的ＰａｔＤＸＲ蛋白含有两个ＮＡＤＰＨ结合基序和ＤＸＲ逡逑活性位点（图１－２）。在这项研宄中，ＰａｔＤＸＲ表现出组织差异性表达，其在花逡逑量最高，其次是叶和茎（图１－１）。逡逑后在ＭＣＴ催化的ＣＴＰ依赖性反应中将ＭＥＰ转化为４－（胞苷５＇－二淲酸）－２－Ｃ－逡逑－赤藓糖醇（ＭＥＰ）。在我们的ｃＤＮＡ文库中筛选了两个基因，并且衍逡逑白质含有保守的ＩｓｐＤ基序，并且构建系统进化树发现这２个基因与其他植物逡逑Ｔ具有高度同源性。ＰＭＭＣＴ１和主要在叶片中表达，在花和茎中表达逡逑低（图１－１）。在ＭＥＰ途径的接下来三个反应中，ＣＭＥ的Ｃ２位置的羟基进一逡逑ＭＫ磷酸化，并且生成的产物２－磷酸－４－（胞苷５’－二磷酸）２－Ｃ－甲基－Ｄ－赤藓糖逡逑ＭＥ）随后被转化为２－Ｃ－甲基－Ｄｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ２，４－环二磷酸（ＣＭＥＣ），然后被ＭＤＳ逡逑然后用ＨＤＳ将ＣＭＥＣ还原为ＨＭＢＯ。基于转录组数据，本研究鉴定了邋１个逡逑Ｓ基因、４个尸ａ／ＭＤＳ■基因和４个Ｐａ／Ｚ／ＡＳ基因。和主要在叶逡逑达。其中和／的转录水平与ＭＥＰ途径中的其他基因家族相似逡逑

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