镉胁迫下马铃薯相关表达基因的转录组测序与候选基因挖掘

发布时间：2020-07-27 12:09

【摘要】：研究不同品种马铃薯镉富集能力的影响因素,能了解环境因素、品种自生因素对马铃薯镉富集能力的影响;根据品种间镉富集能力的差异,筛选6个品种(3个高富集品种,3个低吸收品种)进行不同程度镉胁迫抗性试验。探讨、鉴定这6个品种品种马铃薯发稞期抗镉能力,并建立抗镉强度的数学评价模型,同时通过转录组测序和生物信息学分析找出调控马铃薯高抗、低吸收、高富集的功能基因和转录因子。为品种选育、土壤修复及食品安全提供理论依据。90个马铃薯品种富集系数的变异系数为1.24,初步验证不同品种马铃薯抗镉能力存在差异。另外随机挑选10对马铃薯及相应土壤为实验对象,每种马铃薯种植于3种不同土壤环境。以多因素方差分析法分析土壤镉迁移能力及影响因素;用K均值聚类法(聚类指标:pH、有机质、CEC、总镉、有效镉)、T-检验分析不同土类下,同种马铃薯镉富集能力;同种土类下,不同种马铃薯镉富集能力结果表明:土壤有效镉含量的差异主要受到总镉和土壤理化性质的综合影响。土壤总镉越高、pH越低的区域P=5.639e-0.5,有效镉明显偏大,马铃薯镉富集能力增强;另外共有5种聚类土壤,7种块茎镉含量差异。威芋5号在第二类土壤中,含量为0.061mg/kg,在第三类土壤中,含量为0.091mg/kg等也表明外界环境对马铃薯富集镉能力有影响;而在第一类土壤中,宣薯2号(a)富集能力最强,云薯505(e)最弱。说明品种因素也能影响马铃薯富集镉的能力。依据不同马铃薯富集系数、生物有效性选出6个品种进行抗镉盆栽试验。采用盆栽沙培方式,设置正常组(CK)、短期镉胁迫(S)和长期镉胁迫(L)三个处理,对6个不同马铃薯品种在不同处理下的株高、最大节间距、分蘖数等农艺性状及光合能力、叶片酶活性18个等生理生化指标进行测定。利用隶属函数法、主成分分析和聚类分析对各马铃薯品种抗镉能力进行综合评价,并用逐步回归分析建立最优回归方程进而实现对马铃薯抗镉能力的预测与鉴定。差异性分析结果表明镉胁迫对马铃薯各指标均有显著影响。以主成分分析将这些指标转化为5个相互独立的综合指标(累计贡献率达83.55%),并算出单个因子抗镉贡献率及6个品种抗镉能力(D);将D值作因变量,各指标抗镉系数作自变量进行逐步回归分析。筛选出叶绿素b、CAT、ETR这3项对马铃薯耐镉能力有影响的指标,预测结果与D值极显著相关(调整R~2=0.940~(**)),表明用此方程对马铃薯抗镉特性进行预测具有一定的准确性及高效性,能简单化马铃薯抗镉特性的鉴定工作;将不同品种抗镉能力聚类分析得出参试品种分为3大类型,即威芋7号、云薯801为抗镉型品种;云薯505、毕薯2号、LZ川为中间型品种;青薯9号为不耐镉品种。根据聚类结果挑选抗镉能力最强3个品种叶片转录组测序。使用Illumina平台RNA-Seq来分析11个不同时间、不同镉浓度处理马铃薯的cDNA文库。以有参转录组分析为标准,确定了3458个和3422个对镉敏感的上调基因和下调基因。其中31个基因和49个基因的核心组同时在所有样本上调或下调。此外,ManMap分析表明,在短期胁迫组中,品种的不同导致差异基因行为不一致;在长期胁迫组中,品种间差异基因的行为较一致。较自身空白组,短期胁迫的差异基因主要发生在在光合系统、激素系统和氧化还原系统;而长期胁迫组则涉及到植物体各个系统中。从不同处理组涉及差异基因表明,由于与光合相关基因的发生变化导致其性状(光合速率、荧光参数)下降;而与激素系统、氧化还原系统等基因变化有可能是响应或者镉胁迫产生的影响。另外,共表达基因集合、共表达网络分析、Cytospace网络分析得到的候选基因经透视化后获得10个转录调控模块,这些模块主要行使物质合成、光合作用、物质修复功能。同时根据共表达网络GG、MS值获得核心基因共1152个,其中包含72个与镉胁迫相关的转录因子家族、植物激素合成及控制离子通道等候选基因,它们可能是叶片中的主要调控中心。此外本批转录组中共有46000条转录本,共包含22个NAC家族,而核心基因中发现10个NAC家族的转录因子随着胁迫程度的加深、马铃薯抗镉能力的增加而表达量增高。这些发现有利于进一步了解马铃薯抗镉的分子机制,有助于改良马铃薯。
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：X53;S532
【图文】：

示意图,技术路线,示意图

技术路线示意图

样品分布,马铃薯,土壤,密闭罐

图 2-1 土壤-马铃薯样品分布图2.1.2 样品测定土壤 pH 值采用水浸提-电位法( 水土比为 2.5mL:1g) 测定;土壤有机质、CEC 的测定方法参《土壤农业化学分析》［51］；土壤总镉采用硝酸-高氯酸-氢氟酸高压密闭罐消解、土壤不同形态镉采用 BCR 法测定、马铃薯中镉采用 HNO3-HCLO4高压密闭罐消解，石墨炉原子吸收法测定消煮样品镉含量，分析过程中加入国家土壤标准物质 GSS-5 和 GSF-3 进行质量控制。2.1.3 数据处理数据分析与作图采用 SPSS20.0,EXCEL2007 和 R 语言软件。2.2 结果与讨论

镉含量,马铃薯,弱酸,提取效果

马铃薯镉(mg/kg) 0.006 0.164 0.03 0.021 0.7富集系数(%) 32.08 0.41 0.024 0.035 1.422.2.2 不同品种马铃薯镉富集状况及影响因素分析如图 2-2 所示，研究区域土壤总镉为 0.704～1.970mg/kg，均值为 1.394 mg/kg，变异系数 25％。进行 CaCl2、BCR（回收率 86％～108％）分级提取有效镉、弱酸态镉占总镉比例为 26％～56％、28％～58％。有效镉和弱酸态镉相关系数 R=0.97，表明用单一提取剂 CaCl2提取有效镉与 BCR 提取的有效镉效果几乎一致，而 CaCl2提取效果偏低于 BCR 提取效果主要是不同提取剂提取土壤镉能力差异。马铃薯块茎镉含量为 0.030～0.146mg/kg，均值 0.086mg/kg，变异系数为 34㳠。对 10 个不同品种马铃薯镉含量进行显著性差异分析,获得 7 个差异类别：a＞ab＞bc＞bcd＞cd＞de＞e。其中宣薯 2 号(a)平均镉含量最大，为 0.130 mg/kg；云薯 505(e)平均镉含量最低，仅 0.039 mg/kg，详见图 3。

【参考文献】