成熟玉米籽粒中5-甲酰四氢叶酸代谢关键基因的发掘及功能分析

发布时间：2020-07-26 22:05

【摘要】：叶酸是一种人体必需的维生素,参与人类生命代谢活动的很多过程。在许多不发达国家,人群叶酸的摄入主要是从主粮作物中获得。然而,主粮作物中的叶酸含量普遍偏低,由此使得叶酸缺乏成为一个全世界范围的营养健康问题。玉米是世界上总产量最高的粮食作物之一,全球范围内超过3亿的人口以玉米为主粮。通过遗传学手段发掘玉米籽粒中叶酸变异的遗传基础,可以改善玉米籽粒中的叶酸水平,克服叶酸缺乏营养健康问题。本研究通过全基因组关联分析的方法,发现了玉米籽粒中与叶酸主要形式5-F-THF含量变异显著相关的新基因ZmGFT1。在此基础上,利用候选基因关联分析、连锁分析、表达分析、单倍型分析和进化分析鉴定了该基因内潜在的功能等位变异,并通过转基因验证了该基因的功能。这些发现为玉米叶酸代谢调控的研究奠定了新的遗传学基础,也为通过分子设计提高玉米及其他作物的叶酸营养品质提供了新思路。本研究取得的主要研究结果如下:1、通过对关联群体中的531份玉米自交系在三个环境下收获的成熟籽粒进行叶酸分析发现,5-F-THF是玉米成熟籽粒中存在的主要叶酸形式,在玉米籽粒中存在丰富的遗传变异。对三个环境下表型数据进行整合,获得的BLUP数据显示,5-F-THF的含量从0.58到8.18 nmol/g DW,均值为1.66 nmol/g DW。方差分析显示5-F-THF的表型变异在基因型间达到了极显著水平。对三个环境下的5-F-THF含量进行遗传力分析,发现其遗传力达到了0.79。这说明5-F-THF的表型变异主要是由遗传因素控制的,可以通过遗传定位手段鉴定出控制该表型变异的遗传因素。2、利用玉米基因组中已经获得的558529个SNPs作为基因型,对5-F-THF含量进行全基因组关联分析发现了36个与5-F-THF含量显著关联的位点,这36个位点分布在玉米5条染色体的9个基因上。其中,8个位点定位到第五条染色体一个潜在的叶酸代谢相关基因谷氨酸亚胺甲基转移酶I(Glutamate formiminotransferase I,GFT1)上,基因编号GRMZM2G124863。该基因内存在两个处于完全连锁不平衡状态的位点Chr5.s_19676906和Chr5.s_19676907,与5-F-THF含量关联最显著,它们的P值均达到了1.46×10~(-21)。这两个位点的共同变异导致该基因中编码的氨基酸发生天冬酰胺和甘氨酸的转变,这种变异可以解释5-F-THF含量变异的27.6%。3、对155个自交系材料的关联群体中GFT1基因进行扩增重测序分析,候选基因关联分析结果显示有80个多态性位点与5-F-THF含量显著关联。在80个显著关联位点中,其中24个位于5’UTR,8个位于第二个外显子,48个位于内含子中。再次发现了全基因组关联分析中找到的显著关联等位变异Chr5.s_19676906和Chr5.s_19676907。还发现了4个位于该基因5’UTR显著关联的InDel位点:S422、S637、S649和S696。通过表达分析和5-F-THF含量分析表明这4个InDel位点也是潜在的影响5-F-THF含量的功能位点。4、授粉后15天种子中基因表达量作为表型,558529个SNPs作为基因型,进行全基因组关联分析结果显示在第五条染色体ZmGFT1位置发现了一个表达QTL(P=7.15×10~(-13)),这表明ZmGFT1中可能存在顺式调控机制来调节该基因的表达。利用玉米自交系GEMS31和Dan3130构建的F_(2:3)分离群体定位到一个与5-F-THF含量相关的QTL,与ZmGFT1共定位,这个QTL可以解释5-F-THF含量变异的14.9%。5、对获得的6个显著多态性位点进行单倍型分析发现,Hap1、Hap4、Hap7在Chr5.s_19676906的基因型均为G,三种单倍型的5-F-THF含量显著高于其他单倍型。Hap1综合了所有的优良等位变异,叶酸含量最高,达到了2.12 nmol/g DW。9种单倍型可以解释5-F-THF表型变异的40%。转基因拟南芥种子结果显示,Qi319-GFT1的过表达拟南芥种子5-F-THF的含量比col野生型显著提高,B73-GFT1过表达转基因种子5-F-THF与col野生型没有明显差异。Qi319-GFT1和B73-GFT1过表达转基因拟南芥种子5-M-THF含量比col野生型都显著下降。转基因玉米叶片中结果显示,B73-GFT1过表达玉米叶片中5-F-THF含量比对照显著提高,而RNAi玉米叶片中5-F-THF含量比对照显著降低。利用Swiss-Model同源建模预测的ZmGFT1的三维蛋白结构表明,ZmGFT1的结合口袋位于该蛋白的两个原聚体的界面上,而多态性位点Chr5.s_19676907引起变化的氨基酸也位于两个原聚体的界面上,可能会造成该蛋白结合口袋的空间结构发生变化,影响蛋白的功能。对ZmGFT1进行亚细胞定位分析发现,ZmGFT1与细胞核和内质网有共定位,与线粒体、叶绿体、过氧化物酶体和高尔基体没有共定位。在利用玉米的表达数据构建的共表达网络中发现,与拟南芥直系同源的叶酸代谢相关基因中,只有ZmMTHFR与ZmGFT1有共表达关系。共表达网络中还发现了17个新基因与ZmGFT1有共表达,其中13个基因可能与叶酸相关的生物过程有关系。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S513
【图文】：

四氢叶酸,衍生物,化学结构,叶酸

献综述叶酸背景介绍叶酸的化学结构酸，也称为维生素 B9，是一种水溶性 B 族维生素，是叶酸及其衍生物的由三部分组成：对氨基苯甲酸（p-ABA）蝶呤、和不同谷氨酸残基组成不同氧化水平的一碳单位（甲基、甲酰基、亚甲基、次甲基、亚胺甲过叶酸代谢相关酶的作用连接到蝶呤的 N5 或 p-ABA 的 N10 位置，形平的叶酸衍生物，在不同的代谢途径中发挥不同的功能（图 1.1）。自很不稳定，对光、氧化、热和酸都很敏感，极易发生分解，造成蝶呤和生断裂 (Gregory 1989)。而在生物体内，叶酸通过形成抗氧化复合物某些叶酸结合蛋白结合增加其稳定性 (Scott et al 2000)。

叶酸,植物,途径,粒体

华中农业大学 2019 届博士研究生学位（毕业）论文（HMDHP）进入线粒体。进入线粒体的 HMDHP 经过二氢蝶呤焦磷酸激酶催成 6-羟甲基二氢蝶呤焦磷酸（HMDHP-P2）。p-ABA 的合成是在叶绿体中以分支底物开始的，分支酸依次经过分支酸合成酶(ADCS)和分支酸裂解酶(ADCL)催成 p-ABA 进入线粒体。HMDHP-P2和 p-ABA 在二氢蝶酸合酶(DHPS)的作用下二氢蝶酸（DHP）。DHP 与谷氨酸(Glu)在线粒体内的二氢叶酸合成酶(DHFS)的下生成二氢叶酸(DHF)，DHF 在二氢叶酸还原酶(DHFR)作用下生成四氢叶酸（T图 1.2）。

叶酸缺乏,新生儿,患病率,叶酸

图 1.3 基于叶酸缺乏的 NTDs 患病率高危区域（每万个新生儿患 NTDs 数）(Blancquaert et a2014)Figure 1.3 Risk regions of folate deficiency based on NTD prevalence (number of NTDs per10000 births) (Blancquaert et al 2014)1.1.8 叶酸的补充现在，克服叶酸摄入不足主要是通过在食物中强制添加人工合成的叶酸或者通过补充叶酸片来满足人们对叶酸的需求 (Botto et al 2005; Bouis 2002)。叶酸被人体吸收后，先被还原成有活性的 DHF 和 THF，然后再转变成其他可利用叶酸形式参与各种反应 (Mcguire and Coward 1984)。另外，人类还可以从一些叶酸含量较高的食物中获取叶酸，如鸡蛋、酵母、动物肝脏和绿叶蔬菜等。但是有报道指出摄入人工合成叶酸过多会给人类健康带来一些不好的影响 (Blancquaert et al 2014; Marean eal 2011; Mills et al 2003; Ray et al 2003; Takimoto et al 2011)。并且这些方法的成本都是很高的，对于生活在贫困地区的人口难以实现。普通成年人每天建议的叶酸摄入

【参考文献】