水稻花期特异表达的转录因子OsbZIPX的功能研究

发布时间：2020-07-27 14:01

【摘要】：水稻是严格自花授粉作物。水稻颖花开放是由浆片吸水膨胀启动的,浆片膨胀时向外推挤内稃和外稃,从而撑开内稃和外稃之间的钩合使得颖壳张开,同时花丝伸长、花药伸出颖壳并开裂,花粉散落,柱头也伸出颖壳以便授粉。水稻开颖是极其复杂且受许多基因精确调控的过程,并且容易受环境因素的影响,比如光、温度等。水稻颖花的适时开放和闭合对于水稻的产量,杂交水稻制种至关重要。前人的研究表明茉莉酸、可溶性糖、无机离子运动、二氧化碳积累等生理生化过程参与了水稻开颖过程,然而这些过程背后的分子机制及调控机制的研究却几乎空白。究其原因主要是缺乏合适的闭颖突变体。水稻花期特异表达转录因子OsbZIPX,其T-DNA插入突变体bzipx表现为闭颖自花授粉,但是其生长结实并未受显著影响,该突变体是研究水稻闭颖的分子机制的绝好的遗传材料和基因资源。本研究利用反向遗传学等方法获得了该基因的一系列转基因材料。利用这些材料,采用现代分子生物学及遗传学的方法展开了系统的研究,探寻OsbZIPX介导的水稻开闭颖的分子机制。本研究主要取得了下面一系列的结果:1.bzipx植株表现为闭颖自花授粉。OsbZIPX是课题组早期收集的穗期高温响应转录因子之一。T-DNA插入突变体bzipx植株相比野生型更加紧凑,叶片直立,且表现为闭花授粉。形态观察发现bzipx虽然闭颖,但是开花的其它过程,包括花丝伸长、花药开裂等均不受影响,因而可以通过花丝状态来判断突变体颖花开花的‘花时’。统计‘花时’结果表明bzipx日开花时间较野生型迟2小时;浆片形态观察表明与野生型开颖时膨胀后的浆片相比,突变体到达‘花时’时的浆片体积较小、鲜重较轻、表皮细胞膨胀程度较弱。石蜡切片结果进一步验证了该观察结果,bzipx的浆片在‘花时’相比野生型瘦小,野生型的颖花浆片在开颖时经过充分膨胀,浆片外缘有较多组织嵌合入内外稃之间,从而撑开勾合,颖花开放;而突变体浆片虽然也有一定程度的膨胀,但是仅仅只有少量的浆片外缘嵌合入勾合不足以撑开内外稃,导致闭颖。2.OsbZIPX偏好在颖花中表达,是一个转录激活子。组织荧光定量PCR显示OsbZIPX在颖花中,特别是0-2cm的花序中表达最高。由OsbZIPX启动子(0-4kbps)驱动的OsbZIPX与GUS的融合蛋白组织染色显示融合蛋白在花药、浆片中大量表达。酵母转录实验结果显示,OsbZIPX具有转录激活功能;亚细胞定位结果显示OsbZIPX蛋白主要定位在细胞核内。暗示该转录因子是一个转录激活子。3.OsbZIPX过表达植株的叶夹角增大,OsbZIPX的表达可能与油菜素内酯(Brassinosteroids,BR)相关。OsbZIPX过表达植株表现为叶夹角增大、种子变大等BR相关表型,与bzipx突变体表现出的叶型紧凑、叶片直立正好对应。我们利用qRT-PCR检测水稻中BR合成基因的表达,结果表明过表达植株中OsCPD基因上调。石蜡切片显示过表达植株的浆片细胞较野生型有所增大,均一性更好,表明OsbZIPX可能参与BR途径调控水稻生长发育。4.OsbZIPX促进开颖过程中JAZs基因的表达。茉莉酸能促进水稻开颖。通过qRT-PCR分析野生型、bzipx、bZIPX过表达植株在开花前与开花时颖花中JAZs基因的表达水平,结果显示:与野生型相比,突变体中多个JAZs基因的表达减弱,而过表达植株中JAZs基因中则显著增高。双荧光报告分析实验显示OsbZIPX基因可以促进部分JAZs基因的表达,表明OsbZIPX在水稻开颖过程中能促进茉莉酸信号的传递。5.OsbZIPX与OsDLT在酵母中互作。由于全长OsbZIPX蛋白具有很强的自激活活性,而OsbZIPX的蛋白N端(0-265aa)则不具有转录激活功能,利用OsbZIPX的N端筛选水稻花序cDNA文库,结果显示OsbZIPX的蛋白N端与BR信号传递相关基因OsDLT存在互作。我们推测OsbZIPX可能通过OsDLT参与BR途径。OsbZIPX与OsDLT的相互作用还有待进一步的验证。综上所述,OsbZIPX参与调控水稻开颖的机制可能是通过协同调控BR与茉莉酸途径来实现的,在水稻花发育早期,通过促进BR合成或信号传递促进浆片细胞发育增大,在开颖时OsbZIPX又通过促进茉莉酸途径的信号传递促进水稻开颖。后续我们还将对OsbZIPX如何通过调控JA和BR信号之间的交叉对话来精细调控水稻颖花的开放开展研究,最终为水稻开颖的分子机制的解析提供基础。
【学位授予单位】：浙江师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S511
【图文】：

过程图,水稻,开闭,过程

水稻开颖的机制水稻的颖花（小花）由一对护颖、外稃、内稃、1 枚雌蕊(拥有两个柱头枚雄蕊，以及对称分布于内外稃之间、子房基部的一对浆片组成。水稻是自花授粉的作物。水稻颖花开放（图 1）是由浆片的快速吸水膨胀驱动的吸水膨胀向外推挤外稃从而分离内稃和外稃之间的勾合颖花开放；颖花开同进行的还包括了花丝的伸长、花药开裂散粉、柱头的弯曲外露等过程；终完成授粉后，较短的时间内浆片又迅速的失水萎蔫，颖壳又重新闭合为的发育及后期灌浆提供一个密闭的空间[70]。因此对水稻开颖的研究主要集开颖前后对浆片的细胞形态观察和膨胀机制的探究。稻开颖的研究进展

花序,小花,花絮,花药

31图 3.1 O sbZIPX 表达模式a：OsbZIPX 偏好在抽穗期花序中表达（Genevestigator）； b：OsbZIPX 基因在生殖器官过程中的表达谱。用的是安捷伦科技公司的单色基因芯片分析系统，将 48 个样品（每品三个重复）用于杂交。OsbZIPX 基因的表达谱用 Cy3 信号强度和标准化数据（log示。其中数字表示：1、花序（0.6-1.0mm），2、花序（1.0-1.5mm），3、花序（1.5-2.0mm花序（2.0-2.5mm），5、花序（2.5-3.0mm），6、花序（3.0-4.0mm），7、花序（4.0-5.0mm花序（5.0-10mm），9、花药（0.3-0.6mm），10、花药（0.7-1.0mm），11、花药（1.2-1.5mm、花药（1.6-2.0mm），13、雌蕊（5-10cm 的圆锥花絮），14、雌蕊（10-14cm 的圆锥花絮、雌蕊（14-18cm 的圆锥花絮），16、外稃（1.5-2.0mm 的小花），17、内稃（1.5-2.0小花），18、外稃（4.0-5.0mm 的小花），19、内稃（4.0-5.0mm 的小花），20、外稃（7.0小花），21、内稃（7.0mm 的小花）；c：不同长度幼穗中 OsbZIPX 基因的表达情况

突变体,插入位置,部位,条带

3.2 OsbZIPX 突变体的获得与鉴定实验室从韩国商业突变库购买了 OsbZIPX 的 T-DNA 插入突变体 bzipx（本实验室命名为突变体 154），遗传背景为华阳（HY），T-DNA 插入在该基因的第3 内含子上（图 3.2 a），设计了一对基因特异引物 154R 和 154L 以及 T-DNA 插入边界引物 LB2 用于鉴定该 T-DNA 插入。基因特异引物（154R，154L）能够扩增出条带、T-DNA 插入鉴定引物（154L，LB2）不能扩增出条带的是野生型；基因特异引物能扩增出条带、T-DNA 引物也能扩增出条带的是杂合型；而基因特异引物不能扩增出条带，T-DNA 引物能扩增出条带的是插入纯合型 bzipx 突变体；如图 3.2 b 所示，杂合型的有（泳道）：4、6；纯合型的有（泳道）：1、2、5、7。实时荧光定量 PCR 显示，OsbZIPX 的表达在 T-DNA 插入杂合突变体和纯合突变体中表达下降，甚至阻断（图 3.2 c）。

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