甘草酸生物合成途径中GuGDHs与GuCPR基因的克隆及GuGDHs的活性分析

发布时间：2020-07-27 15:47

【摘要】：甘草具有补脾益气,清热解毒,祛痰止咳,缓急止痛等功效,甘草酸是甘草的主要活性成分,甘草酸的含量是《中国药典》列入的衡量甘草药材品质优劣的主要指标。甘草酸药用价值与工业价值显著,不仅运用于临床治疗,还广泛应用于化妆品、食品、保健品等行业。目前,仅靠种植甘草无法满足其巨大市场需求,同时,种植甘草周期长,品质优劣不一,过渡采挖甘草造成土地沙化、土壤贫瘠、生态环境破坏等严重问题,因此,采用新兴科学技术获得甘草酸已成为甘草资源研究的热点问题。近年来,随着合成生物学技术的飞速发展,人们对于甘草酸生物合成途径的研究日趋成熟,因此,运用合成生物学技术人工合成甘草酸有望成为缓解甘草酸市场供不应求,改善甘草种质资源的重要方法。目前,甘草酸生物合成途径中的关键基因多数已被成功表征,甘草酸的生物合成通路已基本打通,科学家已在酵母中合成了甘草酸的前体——甘草次酸。然而,甘草酸中下游途径中的UDP-葡萄糖脱氢酶(GuGDHs)与细胞色素P450还原酶(GuCPR)仍未被成功解析。甘草酸糖基转移酶需在UDP-葡萄糖脱氢酶(GuGDHs)催化作用下,方可催化甘草次酸生成终产物甘草酸;甘草酸细胞色素P450还原酶(GuCPR)为细胞色素P450的催化过程提供电子,是细胞色素P450超家族酶中的重要成员,因此,解析甘草酸UDP-葡萄糖脱氢酶(GuGDHs)与甘草酸细胞色素P450还原酶(GuCPR)对甘草酸的生物全合成至关重要。因此,本文研究内容及主要研究成果如下:1.通过本课题组前期转录组数据库与NCBI上报道的同源基因比对,筛选出了3条候选甘草酸UDP-葡萄糖脱氢酶(GuGDHs),命名为GuGDH1、GuGDH2、GuGDH3;筛选出了1条甘草酸细胞色素P450还原酶(命名为GuCPR)全长编码序列,并以cDNA为模板,基于PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应)技术,通过特异性引物扩增,克隆了GuGDH1、GuGDH2、GuGDH3与GuCPR的完整编码区(CDS),得到了3条1000bp左右和1条2000bp左右的条带,并通过连接pEASY-Blunt载体得到GuGDH1、GuGDH2、GuGDH3与GuCPR的克隆重组质粒。基于蛋白结构预测与系统进化树分析,显示GuGDH1、GuGDH2、GuGDH3归属于UDP-葡萄糖脱氢酶超家族,GuCPR归属于细胞色素P450还原酶超家族。此外,利用相关生物信息学分析方法分析了GuGDHs与GuCPR的基本特性。2.通过同源重组方法构建了GuGDH1、GuGDH2、GuGDH3的pET-30a(+)原核表达载体,并在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中异源表达。通过IPTG(异丙基硫代半乳糖苷,Isopropy1 β-D-Thiogalactoside)诱导表达,获得GuGDH1、GuGDH2、GuGDH3重组蛋白。3.通过酶促反应催化实验,检测NADPH在340nm处吸光度的增加来确定甘草酸UDP-葡萄糖脱氢酶(GuGDHs)的活性,证明了GuGDH1、GuGDH2具有活性,而GuGDH3不具有活性。本文研究成果可为下一步解析甘草酸生物合成途径奠定基础。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S567.71
【图文】：

甘草,甘草总黄酮,小肠吸收,甘草黄酮

图１－１甘草三萜类化合物逡逑ａ．甘草酸ｂ．甘草次酸逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｃｏｍｐｏｕｎｄ邋ｏｆ邋Ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ邋ｆｒｏｍ邋Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ邋ｕｒａｌｅｎｓｉｓ逡逑ａ．邋Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｃ邋ａｃｉｄ邋ｂ．邋Ｇｌｙｃｙｒｒｈｅｔｉｎｉｃ邋ａｃｉｄ逡逑１．２黄酮类成分逡逑甘草黄酮同样有抗肿瘤、抗凝血、抗血栓、抗氧化等显著的药理活性。近年逡逑来，甘草黄酮的抗ＨＩＶ病毒作用多见报道。以甘草总黄酮测定经大鼠小肠吸收逡逑前后ＨＩＶ病毒逆转录酶和ＨＩＶ病毒整合酶的活性，结果表明甘草总黄酮经大鼠逡逑小肠吸收后的供试液不具有抗ＨＩＶ病毒活性，进而表明甘草总黄酮的抗ＨＩＶ病逡逑毒作用Ｍ。此外，研宄表明，甘草叶中富含的甘草总黄酮可以诱导单核巨噬细胞逡逑

甘草,亚细胞定位,比对分析

析蛋白的结构．ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ．ｃｏｍ／ｂｅｒｒｙ．ｐｈｔｍＬ邋？ｔｏｐｉｃ＝进行蛋白亚细胞定位预测。ｒｇ／ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／）进行蛋白质三级比对分析，并构建系统进化树。逡逑取逡逑如下图所示，１８Ｓ和２８Ｓ两条较高，可用于下一步实验。逡逑

电泳图,基因克隆,电泳,甘草

的ＲＮＡ质量较好，完整性较高，可用于下一步实验。逡逑ｒ逡逑图３－１甘草总ＲＮＡ提取结果逡逑Ｆｉｇ．邋３－１邋Ｆｉｇｕｒｅ邋１邋Ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋Ｌｉｃｏｒｉｃｅ逡逑３１逡逑

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