水稻雄性不育基因BM1和结实率调控基因LSSR1的作用机理

发布时间：2020-07-28 14:10

【摘要】：研究水稻颖花的育性机理对于水稻生产具有重要意义。本研究通过~(60)Co-γ诱变获得了一个以中恢8015为背景的无花粉型雄性不育突变体baymax1(bm1)。应用花药半薄切片、透射电镜和扫描电镜等方法鉴定了其不育成因,并通过图位克隆、互补和敲除验证和TUNEL检测等实验研究了该雄性不育基因的功能。主要结果如下:1.通过表型观察发现突变体bm1营养生长正常,单压片镜检结果显示其花药内无可见花粉。2.半薄切片和透射电镜结果显示,突变体bm1中绒毡层在花药发育的第9时期不能向分泌型绒毡层转化,第10时期其胞质内细胞器几乎完全降解,不能合成乌氏体,小孢子不能合成花粉壁,并逐渐降解。3.扫描电镜结果显示,突变体bm1花药壁外表面蜡质结构异常,花药壁内表面和花粉壁表面无排列整齐的颗粒结构。这些结果表明突变体bm1的绒毡层发育与降解异常,不能合成乌氏体,使得小孢子后期发育营养供给不足,最终降解。4.BM1被精细定位于4号染色体上4MD-6与4MD-11之间17.9 kb内。基因注释信息分析和测序分析显示突变体bm1在第4个ORF(LOC_Os04g39470)的第2个外显子上有一个A→T的替换,导致其氨基酸从谷氨酸变成了缬氨酸。互补验证和敲除鉴定结果表明确实是BM1(即OsMYB103)的突变造成了突变体bm1的雄性不育。5.表达谱分析结果显示,BM1 5?端启动子启动其在花药中特异表达,从第5时期开始表达,在第6时期表达最强,在第10时期晚期仍有微弱表达。序列分析和系统发育分析结果显示BM1编码一个R2R3类MYB转录因子,其在多个物种中的同源基因都具有调控花药发育的功能。转录激活活性分析结果显示,BM1确实具有转录激活活性,其C末端的64个氨基酸是主要的激活域。6.TUNEL检测和石蜡切片DAPI染色结果显示,BM1与其拟南芥同源基因AtMYB103一样,反向调控绒毡层的降解。但胼胝质鉴定结果显示,BM1并不像AtMYB103一样调控小孢子生成过程中的胼胝质合成与降解。这说明BM1的功能在进化过程既有一定的保守性,又存在一定的变异。7.综合qRT-PCR结果和相关基因变异产生的表型缺陷分析,表明BM1可能位于MSP1和UDT1的下游,与GAMYB、TDR平行反向调控下游绒毡层降解相关基因的表达和协同调控花粉壁形成相关基因的表达。另一方面,本研究通过反向遗传学方法获得了结实率低的low seed setting rate1(lssr1)突变体株系,并对其结实率低的成因进行了分析。主要结果如下:1.LSSR1是一个花药特异表达基因,主要在减数分裂前期至单细胞花粉期的小孢子生成期间表达。预测LSSR1编码一个GH5类纤维素酶,具有12个活性位点,包括GH5蛋白特有的酸/碱中心和亲核中心,其N端有一段信号肽。2.利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除LSSR1后获得一系列结实率降低的lssr1突变体株系。共分离分析、遗传学分析和多位点单独敲除结果证实LSSR1突变确实是lssr1株系结实率降低的原因。3.lssr1株系其它性状与野生型无显著差异,其雌雄蕊形态及花粉I_2-KI染色也都正常。花粉管体内萌发实验结果表明,受精异常是lssr1株系结实率低的主要原因。lssr1株系受精受阻可能主要由其花粉萌发异常、花粉管穿透失败和生长停滞造成。这些结果表明LSSR1对于水稻正常受精及保障其正常结实是必不可少的。本研究中这两个基因及其功能研究将有利于我们进一步理解水稻育性的分子机制,为保障和提高水稻产量及利用杂种优势奠定理论基础。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S511
【图文】：

颖花,花粉,表型,水稻

华中农业大学博士学位论文位于药室内。正常的花粉呈黄色，碘染后变深蓝色，扫描电镜下呈圆球形，外壁不光滑、有小颗粒物（图 1.1）。花粉发育分为 14 个时期（图 1.2）。1-6 时期，雄蕊原基的 3 层细胞通过分裂和分化形成四层壁细胞包围着小孢子母细胞的结构这四层壁细胞由内至外分别是绒毡层、中间层、内皮层及外皮层。7-9 时期，小孢子母细胞通过减数分裂形成 4 个小孢子。10-12 时期，绒毡层和中间层降解，小孢子进行有丝分裂并积累营养物质，形成成熟的三核花粉。13-14 时期，花粉粒进一步成熟，花粉囊开裂，花粉释放和进行授精。

原理图,不育系,水稻,智能

华中农业大学博士学位论文玉米中，他们加入荧光标记基因作为筛选标记基因，以筛选不育系和转基因保系，并命名为 SPT 技术（Brink et al 2012）。近几年，邓兴旺等提出将该技术用于创制水稻智能不育系，其基本原理是将水稻育性恢复基因（MS）、花粉致死基因（ -淀粉酶基因，AA）和红色荧光蛋白基因（RFP）构建到同一载体上，再转入隐性核不育系中获得转基因保持系（Chang et al 2016）。转基因保持系产生两种花粉，ms 型可育，（MS+AA+RFP）ms 型不育，因此只有 ms 型花粉能与其自身的卵细胞结合，自交产生 msms 型的不育系和（MS+AA+RFP）msms 的保持（图 1.7）。这样既可以保证转基因花粉不会传到其他植株上，又可以保留隐性雄性不育系，并将其用于杂交稻制种中。这种技术可以同时弥补“三系法”和“两系法”的不足，具有广阔的应用前景。不过水稻 SPT 技术的研究刚刚起步，要广泛应用于生产中还需要一定时日，需要育种家们继续努力。

突变体,野生型,花药

可观察到野生型花药呈饱满状、色黄，而 bm1 花药稍微细短一些，且颜色为白色或较透明（图2.1e, f）。压片镜检结果显示野生型花药中充满饱满的深蓝色花粉，而突变体花药中根本看不见花粉，只有棕色的花药壁结构（图 2.1g-j）。再者，用野生型中恢 8015的花粉对 bm1 柱头进行授粉，可正常结实。因此，bm1 突变体是一个农艺性状未受影响的无花粉型雄性不育突变体。2.2.2 突变体 bm1 花药的表型变异部位与时期为了观察突变体 bm1 花药发育过程中出现缺陷的部位和时期，对不同时期的花药进行了半薄切片观察。结果显示：在小孢子母细胞时期至减数分裂完成期（第 6-8时期），突变体花药与野生型花药之间都没有明显的差异，同样具有外壁（Ep）、内壁（En）、中间层（ML）和绒毡层（T），也都生成形态正常的小孢子母细胞（MMC）、减数分裂细胞（MC）、二分体（Dy）和四分体（Tds）（图 2.2a-h）。在第 9 时期时，野生型绒毡层大幅度皱缩，细胞内泡状结构被重吸收，而突变体绒毡层仍保持一定的液泡化（图 2.2i, m）。第 10 时期时

【参考文献】