小麦TILLIING突变体库中CKX1基因突变体筛选体系的建立与优化
发布时间：2020-07-29 16:25
【摘要】：TILLING技术是一种通过使用化学诱变剂EMS进行诱导产生点突变,并通过高通量筛选技术进行突变位点扫描来研究基因功能的反向遗传学技术。该技术从分子水平上建立突变体规模化筛选的技术平台,为研究植物体基因的功能提供了新的方向。本研究在实验室前期工作的基础上,对小麦TaCKX1基因未测序部分进行了序列补充,完善了小麦品种济麦22 EMS诱变TILLING群体,建立并优化了基于HRM技术的突变体检测体系,并对目标基因TaCKX1进行了突变体的筛选。主要结果如下:1.小麦TaCKX1基因序列的补充测序为了更好地研究小麦TaCKX1基因,获得该基因A、B、D三个部分同源基因的全部基因组信息,本研究通过参考NCBI中现有小麦TaCKX1基因序列以及水稻、玉米等相近物种CKX1基因序列信息,使用Primer 5软件设计TaCKX1-B亚组前段、TaCKX1-D全段的测序引物,以小麦栽培品种济麦22号基因组DNA为模板,对本实验室前期未完成测序的亚基因组继续进行克隆。测序结果经序列比对后,确定所测序列为小麦TaCKX1基因未测序列,该结果为本研究后续对该基因的探索奠定了基础。2.HRM突变体筛选体系的建立与优化基于实验室自制的Q-PCR体系,通过改变其中不饱和荧光染料SYBR Green I为饱和荧光染料为Eva Green,并调整体系中的染料浓度、Mg~(2+)终浓度、引物终浓度及模板用量四个方面,对该体系进行优化试验,以建立HRM突变体筛选体系。通过构建仅含一个碱基差异的四个单碱基差异载体为HRM体系优化的模板,优化HRM反应体系中各组分浓度,以达到建立的HRM体系能够区分单碱基突变的目标。经试验优化体系后,确定当反应体系中染料添加量为0.1875μL,Mg~(2+)浓度为4.5 mmol/L,模板量为100~200 ng,引物终浓度为5μmol时,本体系能够区分单碱基差异,对SNP进行分型,达到预期筛选单碱基突变筛选目标的要求。3.小麦突变体扫描检测技术平台的建立为了建立基于HRM技术的小麦TILLING库的筛选,本实验室前期对与籽粒大小和产量相关的小麦TaCKX1基因进行了序列信息的确定。但是,由于HRM技术对筛选引物的特异性要求很高,所以需要对小麦TaCKX1基因三个部分同源亚组基因信息进行进一步的校正。通过再次设计特异性引物,对该基因的三个亚组进行了重测序,校正了之前测序存在的差异位点。本研究利用校正后的TaCKX1基因序列,设计筛选了三个亚组共计51对引物,对其中可以特异扩增出单一明亮条带且无引物二聚体的引物进行进一步的HRM反应。通过对606份EMS诱导的突变体植株基因组DNA的两轮PCR扩增及HRM分析,在TaCKX1基因三个亚组中进行分亚组的突变体筛选,并成功筛选到了由G碱基到A碱基的突变。通过对TaCKX1基因的部分外显子区域进行突变体的预筛选,验证了该平台的运行状况,现已初步建立可以对任意目标基因的突变体进行扫描检测的技术平台。
【学位授予单位】：烟台大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S512.1
【图文】：
1 文献综述突变，如缺失、插入或替换，并对其进行切割。Yang 等[35]通过纯化 CEL I 酶的粗体物、优化酶切体系后发现，当 pH 值为中性时酶切反应效果最佳，且当反应体系中Mg2+和 Zn2+浓度适宜时，酶切反应能够对 SNP 位点进行切割，这不仅降低了TILLING 突变体库筛选的成本，还有效提升了筛选的效率。近年来，发展起来一种基于熔解曲线的筛选方法，相对于酶切法筛选突变体时需要进行后续的 DPAGE 检测，这种方法就简单很多。高分辨率熔解曲线法（HRM），基于普通的 PCR 反应，实时监测双链 DNA 与饱和荧光染料的结合情况，区分单个碱基的差异，是一种新型核酸研究方法。该方法操作简便，速度快、通量高，不受突变碱基位置和类型的局限，无需测序即可确定突变位点的存在[36,37]，现已广泛应用于生命科学、医学、食品和中药材鉴定等领域。1.2.2 TILLING 技术的方法流程
图 2-1 小麦 TaCKX1 三个部分同源基因的结构[91]Fig 2-1 The three homologous gene structure of wheat TaCKX1[91]表 2-2 用于扩增 TaCKX1 基因的 PCR 引物Table 2-2 PCR primers for TaCKX1 gene amplification引物名称Primers name引物序列（5’-3’）Primer sequence (5’-3’)位置和退火温度WC1F0b GCTTTCACCGTAGCAGCATCTCAGAG nr2，62.5℃WC1F2b CGGGGGTGCAACTGCCAAGAG nr83，62℃WC1R2b CTCCTGGTCGGCGGAAAAGGTG nr1436，61.7℃WC1F0d TCACCGCCGTAGCAGCATCTTG nr3，61.5℃WC1F3a GATCATCATCATCACATTAACGCGCCTAG nr142，61.6℃WC1R12d CCCAGCGCCGCATCGAACAG nr1248，62.5℃
当条带中有与目标产物一致的带时，对该产物分析度、浓度及质量检测 法提取野生型济麦 22 号基因组 DNA 后，使用超微量度的检测。经检测，5 个基因组 DNA 样品的 A260/AA260/A230 比值均在 2.0~2.4 之间，说明提取的 DNA样品的浓度均在 2000~5000 ng/μL，浓度较高，符合后检测结果如图 2-2 所示，DNA 有单条主带，且主带下完整、无断裂或降解。M 1 2 3 4 5
本文编号：2774211
【学位授予单位】：烟台大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S512.1
【图文】：
1 文献综述突变，如缺失、插入或替换，并对其进行切割。Yang 等[35]通过纯化 CEL I 酶的粗体物、优化酶切体系后发现，当 pH 值为中性时酶切反应效果最佳，且当反应体系中Mg2+和 Zn2+浓度适宜时，酶切反应能够对 SNP 位点进行切割，这不仅降低了TILLING 突变体库筛选的成本，还有效提升了筛选的效率。近年来，发展起来一种基于熔解曲线的筛选方法，相对于酶切法筛选突变体时需要进行后续的 DPAGE 检测，这种方法就简单很多。高分辨率熔解曲线法（HRM），基于普通的 PCR 反应，实时监测双链 DNA 与饱和荧光染料的结合情况，区分单个碱基的差异，是一种新型核酸研究方法。该方法操作简便，速度快、通量高，不受突变碱基位置和类型的局限，无需测序即可确定突变位点的存在[36,37]，现已广泛应用于生命科学、医学、食品和中药材鉴定等领域。1.2.2 TILLING 技术的方法流程
图 2-1 小麦 TaCKX1 三个部分同源基因的结构[91]Fig 2-1 The three homologous gene structure of wheat TaCKX1[91]表 2-2 用于扩增 TaCKX1 基因的 PCR 引物Table 2-2 PCR primers for TaCKX1 gene amplification引物名称Primers name引物序列（5’-3’）Primer sequence (5’-3’)位置和退火温度WC1F0b GCTTTCACCGTAGCAGCATCTCAGAG nr2，62.5℃WC1F2b CGGGGGTGCAACTGCCAAGAG nr83，62℃WC1R2b CTCCTGGTCGGCGGAAAAGGTG nr1436，61.7℃WC1F0d TCACCGCCGTAGCAGCATCTTG nr3，61.5℃WC1F3a GATCATCATCATCACATTAACGCGCCTAG nr142，61.6℃WC1R12d CCCAGCGCCGCATCGAACAG nr1248，62.5℃
当条带中有与目标产物一致的带时，对该产物分析度、浓度及质量检测 法提取野生型济麦 22 号基因组 DNA 后，使用超微量度的检测。经检测，5 个基因组 DNA 样品的 A260/AA260/A230 比值均在 2.0~2.4 之间，说明提取的 DNA样品的浓度均在 2000~5000 ng/μL，浓度较高，符合后检测结果如图 2-2 所示，DNA 有单条主带，且主带下完整、无断裂或降解。M 1 2 3 4 5
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1 沈文俊;小麦TILLIING突变体库中CKX1基因突变体筛选体系的建立与优化[D];烟台大学;2019年
本文编号：2774211
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