干旱胁迫下小麦脱水素WZY1-2、WZY2互作蛋白的筛选

发布时间：2020-08-13 02:53

【摘要】：小麦是重要的粮食作物,在生长过程中经常遭受环境因素,如干旱、高温、盐渍和重金属的影响,致使其严重减产。LEA蛋白作为植物遭受逆境胁迫的诱导蛋白,可以减轻植物细胞受到的损害,从而对植物起到保护作用。脱水素属于LEA蛋白第二亚家族成员,具有高度亲水性,在植物抵抗干旱胁迫中起到重要作用。本文以郑引1号小麦为材料,克隆得到WZY1-2、WZY2(小麦脱水素蛋白)基因,通过构建原核表达载体与诱饵载体,通过Pull-down技术和酵母双杂交技术,筛选与脱水素WZY1-2、WZY2互作的蛋白,进一步研究该蛋白的功能。其结果为深入解析小麦抗旱的分子生物学机制、小麦分子育种等研究奠定基础。通过研究获得以下结果:1.从小麦郑引1号中克隆到脱水素基因WZY1-2、WZY2,基因编码区长789bp、459bp,分别编码262、152个氨基酸,蛋白质分子量为28KD、15.522KD,属于SK3、YSK2型脱水素。成功构建原核表达载体并转化大肠杆菌BL21(DE3),通过诱导条件的筛选发现WZY1-2的最佳表达条件为在37℃下0.1mM的IPTG诱导6h,WZY2的为在37℃ 下0.2mM 的IPTG 诱导10h。2.GST层析柱纯化WZY1-2、WZY2后,通过Pull-down从小麦总蛋白中筛选到能与WZY1-2潜在互作蛋白有132个,其中96个为未知结构蛋白,36个为已知结构蛋白;与WZY2潜在互作蛋白有75个,其中68个为未知结构蛋白,7个为已知结构蛋白。选取与WZY1-2互作且与抗逆相关蛋白7个,与WZY2互作且与抗逆相关的蛋白6个,通过构建诱饵载体与猎物载体,在酵母菌株Y2HGold中进一步验证其互作。3.通过构建PGBKT7-WZY1-2、PGBKT7-WZY2载体,转化酵母菌株Y2HGold验证其自激活性与毒性作用,发现当AbA的浓度为200ng/ml时都能抑制酵母的本底表达,并且WZY1-2、WZY2在酵母中表达时对酵母无毒性作用。4.将cDNA文库转化含有PGBKT7-WZY2的Y2HGold酵母菌株中,通过检测其转化效率,发现达到8.7×106个单克隆,表明已将几乎全部的文库质粒转化进去。通过后续晒选实验,总共得到21个互作蛋白,其中有9个是与抗逆相关的蛋白,需要进一步在酵母中验证其互作性。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S512.1
【图文】：

ＰＧＥＸ６Ｐ－１－ＷＺＹ１－２、ＰＧＥＸ６Ｐ－１－ＷＺＹ２的表达菌ＢＬ２１（ＤＥ３）用不同浓度终浓度的逡逑ＩＰＴＧ（０．１、０．２、０．５、ＩｍＭ）分别处理（２、４、６、８、１０、１２ｈ）小时ｇ收集对照菌和童组菌逡逑蛋良用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳对诱导后的蛋白进行分析，结果（见

逡逑图２－５ＷＺＹｌ－２（ａ）、ＷＺＹ２（ｂ）在３７°Ｃ条件下，不同ＩＰＴＧ浓度不同T间诱导下的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳图逡逑１：对照；２：对照诱导６ｈ逡逑Ｆｉｇ邋２－５邋Ｔｈｅ邋ＳＤＳ－ＰＡＧＥ邋ｔｅｓｔ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ＷＺＹｌ－２（ａ）ｖ邋ＷＺＹ２（ｂ）ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ＩＰＴＧ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｔｉｍｅ邋ａｔ逡逑３７°Ｃ逡逑１邋：邋ｃｏｎｔｒｏｌ；邋２：邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ邋６ｈ逡逑２．４．３邋ＧＳＴ邋Ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ筛选及质谱鉴定逡逑将在最适诱导条件下诱导的重组蛋白ＧＳＴ－ＷＺＹ１－２和ＧＳＴ－ＷＺＹ２处理后分别等体逡逑积过谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱１、２号和３、４号进行纯化，同时将空的ＧＳＴ蛋白（对照）逡逑同样处理后过谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱５号，然后将提取的小麦叶片总蛋白处理后等体积逡逑过２、４、５号柱子，进行互作蛋白的筛选。将流出液进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测，结果见逡逑图２－６。将蛋白溶液进行质谱鉴定。去掉对照所含的蛋白之后，剩余的则是筛选的靶蛋逡逑白。根据结果显示，与ＷＺＹ１－２潜在互作的蛋白有１３２个，其中９７个为未知结构蛋白；逡逑３５个为已知结构蛋白（表２－２）；筛选与ＷＺＹ２潜在互作的蛋白７５个，其中６８个为未知逡逑结构蛋．白＃邋７个为已知结构蛋白（表２－３）

ＰＧＢＫＴ７－ＷＺＹ２已成功，首先挑取阳性克隆菌，用特异性引物进行菌落ＰＣＲ鉴定。为逡逑了进一步检测构建重组质粒的正确性，对重组质粒分别进行单酶切（ＥｃｏＲＩ）和双酶切逡逑（ＥｃｏＲＩ和Ｓａｉｌ），用１％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，结果如图２－７。提取质粒测序，逡逑结果与目的基因一致，证明载体构建成功。逡逑ＷＺＹ１－２逡逑Ｗ逦＾逦＾逦＾逦卜逦

本文编号：2791414