西藏野生大麦耐（酸）铝的离子机制和相关基因HvABCB25、HvEXPA1的功能鉴定

发布时间：2020-08-13 03:52

【摘要】：铝毒害是影响酸性土壤上作物产量的主要因素,传统的施加石灰的方法并不能经济有效的缓解土壤铝毒害,通过选育耐铝品种或改良现有品种的耐铝性,使之适应酸土环境,是提高酸性土壤上作物产量的有效途径。青藏高原一年生野生大麦具有丰富的遗传多样性,拥有许多优异的抗(耐)性相关基因,是国际大麦界所瞩目的珍贵野生资源,从西藏野生大麦中发掘优良基因,进而应用于栽培大麦或其他作物,对作物品种改良具有重要意义。本研究以课题组拥有的耐铝西藏野生大麦基因型XZ16和铝敏感野生大麦基因型XZ61为材料,以国际公认的耐铝栽培大麦基因型Dayton为对照,利用MIFE(Microelectrode Ion Flux Estimation)技术研究了大麦耐酸性和耐铝性的离子机制及其差异;本课题组前期利用基因芯片技术比较分析了 XZ16、XZ61和Dayton响应铝胁迫的基因表达差异,本研究分离克隆了两个在XZ16中特异响应铝胁迫的基因HvABCB25和HvEXPA1,并利用BSMV-VIGS(Barley stripe mosaic virus induced gene silencing)沉默和同源过表达技术,探讨了这两个基因调控野生大麦耐铝性的机制。主要研究结果如下:1.酸、铝胁迫对西藏野生大麦根尖离子流影响的基因型差异以耐铝性差异显著的西藏野生大麦基因型XZ16(耐铝)和XZ61(铝敏感)以及耐铝栽培大麦基因型Dayton为材料,利用MIFE技术检测了三个基因型酸和铝胁迫下根尖伸长区和成熟区根际pH以及H+K+、Ca2+离子流的变化。结果表明,酸胁迫和铝胁迫导致的离子流的变化主要发生在根尖伸长区,铝胁迫能够明显抑制根尖H+的内吸和K+的外排,且对铝敏感基因型XZ61的抑制作用更强;铝胁迫还导致根尖Ca2+显著外排,而在酸胁迫下,Ca2+离子流几乎没有变化,此外,ATP酶的活性在酸胁迫下显著增强而在铝胁迫下显著降低。这些结果表明,XZ16的耐酸性主要与其较强的H+内吸能力以及较强的根际碱化能力有关,而大麦耐酸性和耐铝性机制的差异可能是由于铝胁迫导致的Ca2+的外排和对ATP酶活性的抑制造成的。2.西藏野生大麦耐铝相关基因HvABCB25的克隆与功能鉴定以XZ16、XZ61和Dayton为材料,比较了野生大麦和栽培大麦HvAACT1基因上游的插入序列,结果发现野生大麦的HvAACT1基因上游没有1-kb和MRL插入且HvAACT1的表达水平显著低于栽培大麦。从之前基因芯片的结果中筛选到一个XZ16耐铝相关的新的ABC家族基因HvABCB25,利用BSMV-VIGS沉默及同源过表达的方法对该基因的功能进行了验证,HvABCB25蛋白序列分析表明,该蛋白包含5个跨膜域和一个AAA功能域,进化分析表明该蛋白的3D结构和AAA功能域从藻类到被子植物的进化过程中一直非常保守,表达特征分析结果表明该基因仅受铝胁迫的诱导,且该诱导仅发生在根尖部位,这恰恰是铝胁迫的主要作用位点。亚细胞定位的结果表明HvABCB25定位于液泡膜上。利用BSMV-VIGS沉默HvABCB25后,植株的耐铝性显著降低,同时该基因的沉默显著增加了铝在细胞质中的积累;相反,HvABCB25的同源过表达显著提高了亲本的耐铝性并且降低了铝在细胞质中的积累,但是对细胞液中总的铝含量没有显著的影响。这些结果表明,HvABCB25是液泡膜上的铝转运蛋白,主要功能是将细胞质中的铝转运到液泡中进行区室化隔离解毒,这属于大麦的内部解毒机制,这一新基因的发现同时也为大麦耐铝性的研究提供了新的方向。3.西藏野生大麦HvEXPA1基因的克隆与功能分析以耐铝的野生大麦基因型XZ16为材料,利用BSMV-VIGS沉默技术对一个在三个基因型间差异表达的expansin家族基因HvEXPA1的功能进行初步探讨,结果表明,对照条件下,该基因在地上部和地下部均有表达,而铝胁迫对该基因的诱导仅发生在根尖部位,且该基因仅受铝胁迫的诱导,对其他三价金属(如Cr、La)以及pH均没有响应。亚细胞定位结果表明,HvEXPA1定位于细胞膜上,生物信息学分析表明,HvEXPA1携带3个结构域,且EXPA1蛋白的3D结构从藻类到被子植物的进化过程中一直十分保守。沉默HvEXPA1显著抑制了对照和铝胁迫条件下根系的伸长、降低了根尖细胞的长度以及根系的干重,然而,该基因沉默对铝胁迫下根系的相对伸长率却没有显著的影响;此外,沉默HvEXPA1显著降低了根尖的铝含量,且降低的铝含量主要来自于细胞壁而不是细胞液。这些结果表明,HvEXPA1是一个能被铝诱导的expansin家族基因,它主要参与根尖伸长区细胞正常的伸长过程并且它可能通过调节细胞壁松散过程中暴露出来的铝结合位点的数量来影响细胞壁的铝含量。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S512.3
【图文】：

综合反应,科研工作者,根系,细胞活动

图１－１植物对错胁迫的综合反应（Ｓｉｎｇｈ等，２０１７）逡逑Ｆｉｇ．邋１－１．Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ邋ｒｅｓｐｏｎｓｅ邋ｏｆ邋ｐｌａｎｔ邋ｔｏｗａｒｄｓ邋ａｌｕｍｉｎｉｕｍ邋ｓｔｒｅｓｓ邋（Ｓｉｉｉｇｈ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１７）．逡逑在过去的几十年里，科研工作者们一直致力于研究铝毒害为什么能如此快速的抑制根系的伸长，他们的研究结果表明，铝毒害会导致细胞周期失调，减少有丝分裂间期裂期的细胞活动，从而导致根系伸长对绍胁迫的快速响应（Ｓａｎｊｉｂ邋Ｋｕｍａｒ等，２００９；邋Ｓｉｌｖ，２０１２），这种机制在多种作物中都被证实，例如小麦（７ｈ＿ｈｃｗ／ｎ邋ａｅｓｆｔ＇ｖＨＷ）邋（Ｌｉ等，逡逑

锻机,植物

外部解毒机制主要包括有机酸的分泌，例如柠檬酸、苹果酸和草酸，这些有逡逑机酸能够在根际螯合铝，降低根际有效铝的浓度，从而达到解毒的目的，这类机逡逑制也是目前被研究的最透彻的一种机制（图１－２）邋（Ｍａ等，２００１邋），Ｍｉｙａｓａｋａ逡逑等（１９９１）的研究表明，招胁迫卜，耐招的苜莆（尸／ｍｓｅｏ／ＭＶＨ／ｇｆｌｒ／ｓ）基因型根逡逑系柠檬酸的分泌量要显著高于铝敏感基因型。Ｄｅｌｈａｉｚｅ等（邋１９９３）通过研宄耐铝逡逑性不同的小麦近等基因系发现耐铝基因型的苹果酸分泌量比铝敏感基因型要高５逡逑到１０倍，Ｒｙａｎ等（１９９５）通过对大量耐错性不同的小麦基因型的研究进一步证逡逑实，铝胁迫诱导的苹果酸分泌是小麦耐铝性的主要原因；Ｍａ等（邋１９９７）还发现，逡逑铝胁迫会诱导决明子（ＣＭｄａｆｏｍＬ．）的柠檬酸分泌，且耐铝基因型的分泌量更逡逑高；此外，Ｆｕｅｎｔｅ等（邋１９９７）通过将铜绿假单胞菌的柠檬酸合酶基因转入烟草和逡逑木瓜中来对其进行遗传改造，结果在显著增加其柠檬酸的分泌的同时，植株的耐逡逑铝性也显著增强，这些结果均表明，有机酸的分泌与植物的耐铝性息息相关。逡逑ＡＩ－ａｃｉｉｖａｌｃｄｃｍ0ｘ邋ｏｆ邋ｏｒｇａｎｉｃ邋ａｃｉｄ邋ｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｐａｌｌｉ邋ｆｏｌｌｏｗｅｄ逡逑

基本原理,基因,区室化,液泡

细胞的内部，因此，除了外部解毒机制之外，植物仍需要一些内部的解毒机制来应对这些逡逑进入到细胞内的铝，这一机制主要包括在细胞质中螯合铝（Ｍａ等，２００１）以及将铝转运逡逑到液泡中进行区室化隔离解毒（Ｌｅｉ等，２０１７）（图１－２），Ｌａｒｓｅｎ等（２００７）在拟南芥上逡逑发现了一个液泡膜上的ＡＢＣ转运蛋白基因，该基因的主要作用是将细胞质中的铝逡逑转运到液泡中进行区室化解毒；Ｘｉａ等（２０１０）在水稻上发现了一个质膜上的ｉＶｒａ／／基因，逡逑该基因主要负责铝向细胞内的转运，敲除该基因会显著降低植株对铝的吸收，从而增强植逡逑株耐铝性；此外，Ｈｕａｎｇ等（２０１２）在水稻上也发现了与基因功能类似的基因ＯｄＬＷ，逡逑该基因虽然表达模式与基因不同，但是功能也是负责将铝转运到液泡中进行区室逡逑化解毒。最近发现的荞麦ＦｅＷＧ／基因功能也与之类似，该基因主要在根尖的皮层中表逡逑达，并且该基因的表达特异性地受铝胁迫的诱导，亚细胞定位结果表明该基因定位在液泡逡逑膜上

【参考文献】