马铃薯糖转运蛋白StSWEET基因的克隆及功能分析
发布时间：2020-08-21 01:46
【摘要】：马铃薯是我国主要的四大作物之一,光合产物糖类的转运为马铃薯块茎形成提供物质基础,马铃薯叶片中同化产物的长距离运输及卸载是关键环节。糖转运蛋白SWEET可以双向转运糖类,还在生长发育、代谢过程和胁迫中发挥重要的功能。本实验根据马铃薯双单倍体全基因组数据库作为数据来源,结合拟南芥和番茄SWEET基因家族,对马铃薯糖转运蛋白(StSWEET)家族进行鉴定和系统的生物信息学分析,并研究了StSWEET家族在青薯9号马铃薯中不同组织的表达谱;StSWEET基因家族在青薯9号马铃薯的生物胁迫与非生物胁迫下的表达。基于表达情况,对StSWEET11和StSWEET16b基因进行了同源克隆及功能分析。1、本文分析得到马铃薯StSWEET家族中有33个基因,命名自StSWEET1-StSWEET17;与已发表的番茄SlSWEET家族29个基因、拟南芥AtSWEET家族35个基因进行聚类。SWEET家族被聚为4个亚族,第一亚族有6个,第二亚族有32个,第三亚族中含有51个,马铃薯SWEET家族占有19个,第四亚族仅有2个,马铃薯大部分基因归于第三亚族。基因结构分析表明每个开放阅读框的内含子数量都不一样,其结构比较保守。StSWEET基因家族基本成簇分布在10条马铃薯染色体上,10号和11号染色体没有分布,StSWEET12d基因目前还未被定位。StSWEETs蛋白家族具有10个保守基序,同一亚族中的蛋白含有相似的保守基序组成,其在每亚族中具有相似的功能。启动子预测分析表明马铃薯SWEET蛋白与细胞生长、发育、次生代谢以及响应生物与非生物胁迫等相关。2、利用qRT-PCR技术分析马铃薯StSWEET基因家族在青薯9号中不同组织表达谱。研究表明大部分StSWEET基因家族在不同组织中呈现特异性表达,在某一组织的特异性表达可能参与了组织的生长发育,调控了相应的功能。StSWEET11基因在叶中特异性高表达,StSWEET16b基因在花中特异性高表达。在根中StSWEET10c的表达最高,StSWEET12e低表达;在茎中,StSWEET1h的高表达,StSWEET1f表达量最低;StSWEET11在叶中表达较高,StSWEET17表达量最低;在花中StSWEET1e高表达,StSWEET1f表达较低;在块茎中StSWEET1d表达较高,StSWEET12e表达低平;在匍匐茎中,StSWEET12c在匍匐茎中表达较高,而StSWEET17低表达。3、利用qRT-PCR技术分析马铃薯StSWEET基因家族在青薯9号的生物胁迫(晚疫病病菌浸染叶片)与非生物胁迫(葡萄糖、果糖和蔗糖处理)下的表达。研究表明StSWEET11基因响应了晚疫病病菌的生长,也对蔗糖较敏感;StSWEET16b基因与晚疫病病菌的生长紧密相关,对果糖和蔗糖稍敏感。在马铃薯晚疫病病菌诱导下,StSWEET10c和StSWEET10d在24h时达到最高表达,尤其StSWEET11的表达量显著上调。StSWEET1d、StSWEET1e、StSWEET2b、StSWEET10a和StSWEET12b的表达量存在下降趋势。在糖胁迫过程中,在根中,StSWEET3,StSWEET10b,StSWEET2c,StSWEET16b和StSWEET16c在葡萄糖胁迫后的表达下调;StSWEET12c在葡萄糖和果糖胁迫后上调,然而在蔗糖胁迫后却呈现下调;StSWEET16a仅在果糖胁迫后上调。在茎中,StSWEET16a,StSWEET17,StSWEET1e和StSWEET10a在葡萄糖胁迫后上调;在果糖和蔗糖的胁迫下,StSWEET11,StSWEET1b,StSWEET12e,StSWEET1f,StSWEET12d,StSWEET1c和StSWEET1d上调。在叶片中,StSWEET1i,StSWEET10c和StSWEET2a在蔗糖胁迫后上调,StSWEET2c在蔗糖胁迫后下调。4、基于基因表达情况,选取在马铃薯青薯9号中克隆StSWEET11基因和StSWEET16b基因。其StSWEET11的CDS为903 bp,编码301个氨基酸,分子量为33591.42 Da,等电点为9.29,具有7个跨膜域,含有两个MtN3/saliva保守结构域。StSWEET16b的CDS为786 bp,编码262个氨基酸,分子量为28838.13Da,等电点为9.66,具有6个跨膜域,含有一个MtN3/saliva保守结构域。利用Gateway技术分别构建StSWEET11基因和StSWEET16b基因的表达载体,分别以LBA4404农杆菌感受态介导进行遗传转化烟草,StSWEET11基因,得到了52株转化苗;StSWEET16b基因,得到了48株转化苗。
【学位授予单位】：青海大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S532
【图文】：
图 1.1 SWEET 蛋白的结构[3,12]Fig. 1.1 Structure of the SWEET protein在拟南芥中发现 SWEET 蛋白有 4 个亚家族分支，其中氨基酸的同源相似比例在 27%和 80%的范围内[10,21]。在绿色荧光亚细胞的分析发现，对于植物中大部分的 SWEETs 家族基因能够细胞质膜上被定位。用纳米传感器运输的方法实验发现，SWEET 家族具有双向糖转运蛋白的作用[13,18]。在拟南芥的特别，第Ⅰ和Ⅱ亚家族分支中发现 SWEETs 蛋白能够作为转运单糖，而第Ⅲ亚家族分支中发现 SWEETs 蛋白能够对蔗糖作用，作为转运二糖。在第Ⅳ分支中，拟南芥中的AtSWEET16和AtSWEET17蛋白能对果糖起双向作用进而保持维持在根部中的果糖。对于韧皮部中的薄壁细胞再向周围韧皮部主要依靠 AtSWEET11 和AtSWEET12 对蔗糖的作用和转运[21,22]。但是在对 AtSWEET16 进行过表达分析分析，对蔗糖、果糖和葡萄糖的转运水平上出现变化。而异源表达 AtSWEET17 后再在突变体中叶片上出现果糖的增加，可能是在叶片上液泡中出来的[23,24]。总之，AtSWEET17 在对果糖输出作用有重要的功能。对马铃薯中 SWEETs 蛋白家
产生更高的病菌，对植株进行危害而感病。而抗病的水稻品种 xa13 基因不仅能产生气体的对病原菌作用的因子（AvrXa7、PthXo3 等），而且还能引起 Os11N3的表达产生抗性[32,33]。Os11N3 基因（也称为 OsSWEET14）与 OsSWEET11 能够产生较为相似作用（图 1.2）。Os11N3 基因的表达升高最先将蔗糖运往外质体，致使病原菌可能最小化的引起防御反应[34,35,36]。研究发现，通过克隆水稻的白叶枯病的基因，发现 xa25 基因（隐性抗病），发现与 OsSWEET14 基因具有相似的同源的蛋白，可能 SWEETs 基因家族相互协调产生抗病作用[37]。在拟南芥 SWEETs 基因家族成员中，AtSWEET2、AtSWEET4、AtSWEET7、AtSWEET8、AtSWEET10、AtSWEET12 和 AtSWEET15 被病原菌丁香假单胞菌引起上调表达[21,36]。在辣椒中，容易感病的植株收到辣椒黄单胞菌的浸染后，UPA16 (MtN3/saliva/SWEET 类型基因）被调节表达上升[13,33]。同时，能诱导拟南芥 AtSWEET4、AtSWEET15 和 AtSWEET17 基因表达变化能被灰霉病菌影响；AtSWEET11 和 AtSWEET12 基因表达上调在二孢白粉菌的作用下[38,39]。Siemens等[40]人研究发现，在拟南芥中 SAG29/AtSWEET15 基因能表达上调，在受到根肿菌刺激后。总之，SWEET 家族成员能够在植物防御和抗病过程中有作用[26,27,29]。
StSWEET16c PGSC0003DMT400063717 gene:PGSC0003DMG400024764 transcript:PGSC0003DMT400063717StSWEET17 PGSC0003DMT400063711 gene:PGSC0003DMG400024762 transcript:PGSC0003DMT4000637112.3.3 马铃薯 StSWEET 蛋白家族的系统进化树的构建将鉴定的马铃薯 StSWEET 的氨基酸序列，与番茄 SWEET 和拟南芥 SWEET同时进行系统进化树的构建。运用软件 MEGA7.0，采用邻接法构建系统进化树。结果显示，如图 2.1，马铃薯 StSWEET 蛋白家族 33 个，与番茄 SlSWEET 家族29 个、拟南芥 AtSWEET 家族 35 个进行聚类，SWEET 家族被聚为 4 个亚族，进化过程中，结构和功能发生变化，但大部分基因关系较近，比较保守。第一亚族有 6 个，第二亚族有 32 个，第三亚族中含有 51 个，马铃薯 SWEET 家族占有19 个，第四亚族有 2 个，马铃薯大部分基因归于第三亚族。
本文编号：2798739
【学位授予单位】：青海大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S532
【图文】：
图 1.1 SWEET 蛋白的结构[3,12]Fig. 1.1 Structure of the SWEET protein在拟南芥中发现 SWEET 蛋白有 4 个亚家族分支，其中氨基酸的同源相似比例在 27%和 80%的范围内[10,21]。在绿色荧光亚细胞的分析发现，对于植物中大部分的 SWEETs 家族基因能够细胞质膜上被定位。用纳米传感器运输的方法实验发现，SWEET 家族具有双向糖转运蛋白的作用[13,18]。在拟南芥的特别，第Ⅰ和Ⅱ亚家族分支中发现 SWEETs 蛋白能够作为转运单糖，而第Ⅲ亚家族分支中发现 SWEETs 蛋白能够对蔗糖作用，作为转运二糖。在第Ⅳ分支中，拟南芥中的AtSWEET16和AtSWEET17蛋白能对果糖起双向作用进而保持维持在根部中的果糖。对于韧皮部中的薄壁细胞再向周围韧皮部主要依靠 AtSWEET11 和AtSWEET12 对蔗糖的作用和转运[21,22]。但是在对 AtSWEET16 进行过表达分析分析，对蔗糖、果糖和葡萄糖的转运水平上出现变化。而异源表达 AtSWEET17 后再在突变体中叶片上出现果糖的增加，可能是在叶片上液泡中出来的[23,24]。总之，AtSWEET17 在对果糖输出作用有重要的功能。对马铃薯中 SWEETs 蛋白家
产生更高的病菌，对植株进行危害而感病。而抗病的水稻品种 xa13 基因不仅能产生气体的对病原菌作用的因子（AvrXa7、PthXo3 等），而且还能引起 Os11N3的表达产生抗性[32,33]。Os11N3 基因（也称为 OsSWEET14）与 OsSWEET11 能够产生较为相似作用（图 1.2）。Os11N3 基因的表达升高最先将蔗糖运往外质体，致使病原菌可能最小化的引起防御反应[34,35,36]。研究发现，通过克隆水稻的白叶枯病的基因，发现 xa25 基因（隐性抗病），发现与 OsSWEET14 基因具有相似的同源的蛋白，可能 SWEETs 基因家族相互协调产生抗病作用[37]。在拟南芥 SWEETs 基因家族成员中，AtSWEET2、AtSWEET4、AtSWEET7、AtSWEET8、AtSWEET10、AtSWEET12 和 AtSWEET15 被病原菌丁香假单胞菌引起上调表达[21,36]。在辣椒中，容易感病的植株收到辣椒黄单胞菌的浸染后，UPA16 (MtN3/saliva/SWEET 类型基因）被调节表达上升[13,33]。同时，能诱导拟南芥 AtSWEET4、AtSWEET15 和 AtSWEET17 基因表达变化能被灰霉病菌影响；AtSWEET11 和 AtSWEET12 基因表达上调在二孢白粉菌的作用下[38,39]。Siemens等[40]人研究发现，在拟南芥中 SAG29/AtSWEET15 基因能表达上调，在受到根肿菌刺激后。总之，SWEET 家族成员能够在植物防御和抗病过程中有作用[26,27,29]。
StSWEET16c PGSC0003DMT400063717 gene:PGSC0003DMG400024764 transcript:PGSC0003DMT400063717StSWEET17 PGSC0003DMT400063711 gene:PGSC0003DMG400024762 transcript:PGSC0003DMT4000637112.3.3 马铃薯 StSWEET 蛋白家族的系统进化树的构建将鉴定的马铃薯 StSWEET 的氨基酸序列，与番茄 SWEET 和拟南芥 SWEET同时进行系统进化树的构建。运用软件 MEGA7.0，采用邻接法构建系统进化树。结果显示，如图 2.1，马铃薯 StSWEET 蛋白家族 33 个，与番茄 SlSWEET 家族29 个、拟南芥 AtSWEET 家族 35 个进行聚类，SWEET 家族被聚为 4 个亚族，进化过程中，结构和功能发生变化，但大部分基因关系较近，比较保守。第一亚族有 6 个，第二亚族有 32 个，第三亚族中含有 51 个，马铃薯 SWEET 家族占有19 个，第四亚族有 2 个，马铃薯大部分基因归于第三亚族。
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1 李明;马铃薯糖转运蛋白StSWEET基因的克隆及功能分析[D];青海大学;2019年
本文编号：2798739
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