天麻miRNA的鉴定与分析及其跨界调控初探

发布时间：2020-08-21 13:45

【摘要】：天麻是我国一种名贵的中药材,具有抗惊厥作用,神经保护,抗炎以及免疫调节等多种功能。目前,关于天麻的研究主要集中于对天麻的粗提物或者天然化学成分的药理研究以及产品开发,还未有任何关于天麻中microRNA的报道。microRNA(mi RNA)是一类长19-24nt非编码的小RNA分子,广泛地参与了人类疾病的代谢过程。它能够通过与靶mRNA结合,从而降解靶mRNA或者抑制其翻译。mi RNA通过对多种信号通路上的关键的因子进行调控,从而影响细胞的增殖、分化和衰老等过程。本项目系统的鉴定和分析了天麻小RNA,并从跨界的角度探讨天麻miRNA在炎症发生过程中的作用,为揭示天麻抗炎免疫的分子作用机制奠定基础,同时为miRNA的跨界调控提供新的证据。首先,利用Illumina高通量测序分析技术对天麻小RNA(sRNA)进行了测序,得到了大量的天麻sRNA。在箭麻和禾麻的花茎芽与块茎四个组织中分别得到了9,798,753个、10,713,576个、11,916,192个和11,229,380个测序read。经过去低质量、去接头和去污染后,得到了9,666,044个、10,508,310个、11,763,094个和11,074,999个Clean reads数。再对clean序列进行了长度分布统计。统计结果显示mi RNA和siRNA相对较多,推测其可能对于调节基因表达起重要作用。结果发现了5718个天麻miRNA,其中天麻特有的全新miRNA共有52个。挑选10个候选miRNA(Gas-miR159,Gas-miR6478,Gas-miR148a-3p,Gas-miR99,Gas-miR143-3p,Gas-miR319f,Gas-miR396e,Gas-miR26a,Gas-miR01和Gas-miR02),利用qRT-PCR进行进一步的验证。10个候选miRNA在不同天麻组织中的相对表达水平与高通量测序结果基本一致。其次,利用qRT-PCR检测了上述10个miRNA在天麻种子、米麻、白麻、箭麻几个时期的相对表达水平。结果显示,Gas-miR319f在种子、米麻和白麻时期表达量相差不大,但是到了箭麻时期Gas-miR319f会急剧升高到原来的20倍。对其中表达量较高且稳定的天麻特有的Gas-miR01和Gas-miR02利用TargetScan和RNAhybrid软件预测其在人类基因组中的靶基因,并进行KEGG分析,结果发现Gas-miR01和Gas-miR02均能靶向NF-κB信号通路上三个关键的炎症发生相关基因A20、TNF-α和IκBα,提示该天麻中特有的两个miRNA分子有可能作为一种重要的小RNA分子,跨界调控NF-κB信号通路上的关键基因,进而参与人类机体免疫和炎症反应等生理过程。进一步利用qRT-PCR检测分别灌胃天麻片煎煮液、天麻粉和天麻总RNA的实验小鼠各个组织中的Gas-miR01和Gas-miR02水平。结果表明,实验组小鼠的各个组织中,天麻miRNA Gas-mi R01和Gas-miR02的含量均明显高于对照组,证实Gas-miR01和Gas-miR02的确能够通过胃肠道进入到小鼠体内。上述结果为进一步研究天麻小RNA的跨界功效提供了基础。最后,将Gas-miR01 mimics、Gas-miR02 mimics和miRNA negative control分别转染至293T细胞中。Western Blotting结果显示,Gas-miR01 mimics和Gas-miR02 mimics均能够下调NF-κB信号通路上的关键蛋白A20。NF-κB被激活时,IKKβ磷酸化A20,从而抑制NF-κB进一步的活化。A20作为NF-κB依赖的蛋白,起到了反馈调节的作用。这一发现为进一步开发天麻类消炎药物提供了一个新的路径,也为后续天麻miRNA作用机制的深入研究提供了新的理论基础。
【学位授予单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S567.239
【图文】：

基本统计,测序,质量,天麻

浙江理工大学硕士学位论文天麻小 RNA 的鉴定与分析及其跨界调控初探(3) Length：原始 read 长度。(4) Q>20 read：为天麻各样本中碱基平均质量值大于20 的 read 条数。(5) Q>20(%)：为 Q>20 read 条数占总 read 条数的百分比。(6) Q>10 read：为天麻各样本中碱基平均质量值大于10 的 read 条数。(7) Q>10(%)：为 Q>10 read 条数占总 reads 条数的百分比。(8) GC(%)：为天麻各样本测序所得碱基中的 GC 含量。(9) Bud1：箭麻花茎芽； Bud2：禾麻花茎芽； Tuber1：箭麻块茎； Tuber2：禾麻块茎。

长度分布,长度分布,块茎,茎芽

13图 3.3 Clean 序列的长度分布统计Fig.3.3 Length distribution of Clean sequences（A）clean total reads （B）clean unique readsBud1：箭麻花茎芽； Bud2：禾麻花茎芽； Tuber1：箭麻块茎； Tuber2：禾麻块茎。Bud1： jianma Bud；Bud2： hema Bud；Tuber1： jianma Tuber；Tuber2： hema Tuber

块茎,茎芽,麻花,花茎

浙江理工大学硕士学位论文天麻小 RNA 的鉴定与分析及其跨界调控初探3.1.3 样本间 Reads 分析针对 clean reads 的 total 数据，得出天麻的同一生长时期的不同组织间和同种组织的不同生长时期间的统计信息（图 3.4）。其中，使用韦恩图表示天麻箭麻花茎芽和块茎以及禾麻花茎芽和块茎样本之间 clean reads 的分析。其中，棕红色的部分表示前者的特有的 cleanreads 数；浅蓝色的部分表示后者特有的 clean reads 数；中间重叠部分表示的是两者共有的clean reads 数。组织间特异的 sRNA 在天麻中往往起着特有的作用。

【参考文献】