吉林35大豆胚尖遗传转化体系的优化及GmMYB12B2基因的遗传转化

发布时间：2020-09-07 18:56

　　大豆(Glycine max(L.)Merr)不仅是重要的经济作物和油料作物,因其富含异黄酮等黄酮类化合物在医药、保健方面也备受关注。随着分子生物学的发展,利用基因工程手段改良大豆品质已经成为可能,本研究优化了大豆胚尖遗传转化体系,构建了高效的过表达载体,将GmMYB12B2基因转入大豆,并完成转基因株系的检测。构建过表达载体pCHF-3300-GmMYB12B2(35S启动子)和pBA-002-GmMYB12B2(大豆种子特异性启动子ProGmOLE8)。以吉林35大豆胚尖为外植体,对胚尖划伤的方式,农杆菌侵染方式及时间,Basta筛选剂浓度等可能影响农杆菌转化的因素进行调整优化,实验结果表明:吉林35胚尖三种划伤方式中纵向划伤植株再生率最高,农杆菌侵染过程中真空侵染最佳时间15min,摇床最佳侵染时间为5h,且摇床5h比真空15min侵染植株的转化率高。在诱芽和抽茎阶段向培养基中添加筛选剂Basta浓度为1.8 mg/L筛选效果最好。综合这几项因素,优化后的体系减少了假阳性的出现,同时胚尖外植体具有高再生能力,在一定程度上缩短了培养周期,说明优化的遗传转化体系是可行的。利用PCR、PAT蛋白试纸条、Southern blot及qRT-PCR方法分别检测和验证每个独立转化事件。PCR和PAT蛋白试纸条初步证明T_0代中有3株(T_0-4、T_0-5、T_0-7)为阳性转GmMYB12B2过表达株系;利用Southern blot杂交进一步验证了T_1代株系,结果证明3株(T_1-4、T_1-5、T_1-7)均为阳性;以吉林35为对照,通过qRT-PCR方法检测了T_1代转基因株系中GmMYB12B2的表达情况,与野生型相比均呈显著性提高,同时检测了异黄酮代谢途径中关键酶基因的表达量变化,其中DFR和FLS的表达量与野生型呈显著差异,CHS的表达量为极显著差异。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S565.1
【部分图文】：

大豆异黄酮

概述济作物和粮食作物，除了富含蛋白质、分也引起了研究者的关注[65]。大豆异黄含量相对较少，主要存在于豆科植物中要作用，成为人们关注的热点。构和性质黄酮类化合物，是以3-苯并砒喃酮为母明：大豆中含有多种大豆异黄酮化合物素，黄豆黄素等[66]。大豆异黄酮只存在,68]。在不同时期不同部位的大豆异黄酮最高，其次是花，茎中的含量较少[69]。

流程图,遗传转化,吉林,大豆

第二章大豆胚尖遗传转化体系的优化探究胚尖划伤方式、侵染方式及时间等可能影响转化效率的因素，进一步确定适合优化后体系的筛选剂筛选浓度。从而提高吉林 35 胚尖遗传转化体系的转化效率。2.2.4 划伤处理对植株诱导率的影响伤口对于农杆菌侵染而言是必不可少的条件之一，而伤口所处的位置，深度关乎着胚尖外植体是否能发育成完整的植株。初生叶位于胚尖顶端分生组织的中心位置，而在顶芽基部及侧芽基部通常分化出很多丛生芽[86]。本环节以吉林 35胚尖外植体为研究对象，通过显微镜观察，去掉胚尖顶端处的两片真叶，在去掉真叶的分生组织处用刀片进行划伤处理，深度约为 2mm，分别以横向、纵向、十字三种方式划伤，如图 2.2 所示。三次重复实验，每个处理切取 50 个外植体，通过观察外植体的生长状态，统计诱导率。

外植体,划伤,大豆,遗传转化体系

第二章大豆胚尖遗传转化体系的优化长状态，统计抗性植株的数量和诱导率。.2.6 筛选剂浓度的确定.2.6.1 筛选剂致死浓度的确定以吉林 35 胚尖遗传转化体系为基础，通过调整筛选剂的浓度找到最适的值。在共培养结束后，向诱芽培养基中加入不同浓度 Basta 筛选剂，其浓度分别为：0.0 mg/L、0.5 mg/L 、1.0 mg/L 、1.5 mg/L、2.0 mg/L。每组设置重复，每次处理外植体 50 个左右。通过观察外植体的生长情况，统计抗性的数量，进而确定筛选剂的致死浓度。

【相似文献】