禾谷类成熟完整籽粒切片技术及其在玉米颖果淀粉研究中的应用

发布时间：2020-09-08 22:09

【摘要】：禾谷类作物成熟籽粒在人类饮食、牲畜养殖和工业生产中发挥着重要作用。胚乳是籽粒的主体部分,被贮藏物质淀粉和蛋白所充实。胚乳细胞、淀粉和蛋白的形态、数量和在籽粒中的空间分布影响着籽粒的产量和品质。越来越多的研究表明,成熟籽粒不同部位的胚乳细胞、淀粉和蛋白表现为异质性,尤以淀粉在高直链淀粉作物胚乳中的异质性最为明显。因此开展成熟籽粒不同区域胚乳细胞、淀粉和蛋白的研究越来越受到人们的重视。然而,由于现有切片技术不能够对成熟完整籽粒进行切片,导致籽粒区域性的原位研究很难开展。本文建立了禾谷类成熟完整籽粒树脂切片技术、非包埋切片技术和胚乳细胞图片加工方法,并利用这些技术方法,研究了玉米发育颖果淀粉的时空积累和特性、高直链淀粉玉米胚乳淀粉的异质性。该研究为禾谷类作物成熟籽粒不同区域的原位观察和分析提供了技术方法,揭示了胚乳细胞、淀粉和蛋白在籽粒中的异质性,丰富了淀粉在发育颖果中的时空积累和特性等知识,也为禾谷类作物品质选育和籽粒加工利用提供重要参考。主要研究结果如下:1.禾谷类成熟完整籽粒树脂切片技术的建立和应用。首先,使用固定液对禾谷类成熟籽粒进行软化和固定,并用锋利刀片将籽粒进行横切或纵切获得完整籽粒组织块;分别用梯度乙醇和LR White树脂对籽粒组织块进行逐级脱水和树脂渗透;最后,将渗透好的籽粒组织块包埋在纯LR White树脂中,获得样品的树脂包埋块。将包埋块在超薄切片机上的样品夹中夹紧,使用双面刀片对包埋块进行修块,随后用玻璃刀对样品进行精修块和干切片;使用铜钩控制切出来的切片以防切片过度卷曲,导致粘在玻璃刀或包埋块上,并将切片转移至载玻片上进行展片和粘片。制备的完整籽粒树脂切片被荧光增白剂、碘液和考马斯亮蓝等分别染色,能够清晰显示胚乳细胞壁、淀粉和贮藏蛋白,用以观察和分析胚乳细胞、淀粉和蛋白的形态、数目和在籽粒中的空间分布。成熟水稻、玉米和小麦完整籽粒的切片结果表明,胚乳不同区域胚乳细胞和淀粉粒的形态存在显著差异、贮藏蛋白主要分布在亚糊粉层区域。成熟完整籽粒树脂切片方法也能对发育、发芽和蒸煮糊化的完整籽粒进行切片。2.禾谷类成熟完整籽粒非包埋切片技术的建立和应用。首先将成熟籽粒夹在切片机样品夹中,或将粘有籽粒样品的树脂底座夹在样品夹中,用锋利刀片将样品表面修平,再用玻璃刀将样品表面精修成镜面。角质或者透明籽粒直接在切片机上用玻璃刀进行干切片,但粉质籽粒在切片前需将无色透明的指甲油涂抹在籽粒粉质区域,经过短时间的干燥凝固后即可切片。在切片过程中,利用铜钩控制切出来的切片以防切片过度卷曲,粘在玻璃刀或包埋块上,并将切片转移至载玻片上进行展片和粘片。利用该方法制备的水稻、玉米、小麦和大麦完整籽粒的切片,经过碘液染色,能够清晰显示淀粉的形态。观察结果表明,禾谷类作物胚乳不同区域淀粉在形态和数量上存在异质性,胚乳透明(或角质)和粉质区域淀粉的形态和大小完全不同。高直链淀粉水稻和玉米完整籽粒的切片分析表明,胚乳不同区域的淀粉不仅形态和大小不同,而且淀粉的特性也具有显著差异。本方法制备的非包埋切片,不仅能够观察淀粉的形态,也能对淀粉的特性进行原位分析。另外,由于该方法能够快速获得成熟籽粒的切片,也可用于从大量禾谷类作物突变体中快速筛选淀粉形态发生改变的突变体。3.胚乳细胞图片加工新方法的建立和应用。首先在Photoshop软件中打开拍摄的胚乳细胞图片,将需要分析的胚乳细胞区域复制和粘贴到一个新建的黑色背景的画布上。用Photoshop软件中的“Pentool”精确勾勒胚乳细胞的轮廓,并保存为“Path”;用“Brushtool”对“Path”进行描边,以便在图像背景上清晰显示胚乳细胞壁。复制黑色的背景图层,并移至图像图层的上方;在背景图层上对“Path”再次描边,生成黑色背景下只有胚乳细胞壁的图层,将该图层保存为图片。水稻、玉米和小麦成熟籽粒的树脂切片,经碘液、番红-甲基紫或荧光增白剂染色获得的胚乳细胞图片,经该方法的加工,不仅能够清晰直观显示胚乳细胞的形态,而且还能用各种形态分析软件直接定量分析胚乳细胞的面积、长短轴和圆形度等形态参数。该方法联合完整籽粒的树脂切片法,不仅能够对禾谷类作物发育和成熟籽粒不同区域的胚乳细胞进行形态观察和形态学参数定量分析,而且还能对籽粒发育过程中胚乳组织的构建过程进行分析。与形态分析软件对拍摄的胚乳细胞直接进行形态学参数的定量分析方法相比,经过该方法加工处理的图片在形态学参数分析时具有耗时短、更精确和易操作等优点。4.完整籽粒切片技术在玉米发育颖果淀粉时空积累研究中的应用。利用本研究建立的完整籽粒树脂切片方法,制备了普通玉米和糯玉米发育完整颖果的切片。利用碘液对切片染色用于观察淀粉在发育颖果中的时空积累。结果表明,果皮淀粉为复粒淀粉,主要分布在果皮下部;随着籽粒的发育,淀粉从果皮上部到下部逐渐降解。胚淀粉主要是单粒淀粉,在授粉后10天开始在盾片中合成和积累。胚乳淀粉在籽粒纵向上由冠部向基部积累,在横向上由胚乳中央向外积累,但淀粉在胚乳外部区域积累速度比胚乳内部快。胚乳淀粉包含单粒和复粒淀粉,复粒淀粉主要分布在胚乳中央区域,在籽粒发育后期主要集中在胚乳下部。分离授粉后20天的胚乳、胚和果皮淀粉,结构特性测定表明,普通玉米果皮淀粉的直链淀粉含量最高,其次是胚乳淀粉,而胚淀粉的直链淀粉含量最低;糯玉米胚乳淀粉不含直链淀粉,果皮和胚淀粉的直链淀粉含量与普通玉米胚淀粉类似;普通玉米和糯玉米果皮、胚和胚乳淀粉均为A-型晶体。淀粉合成相关基因的表达分析表明,参与直链淀粉合成的颗粒结合淀粉合成酶Ⅰ和Ⅱ分别仅在胚乳和胚中表达,但同时都在果皮中表达;参与支链淀粉合成的可溶性淀粉合成酶、淀粉分支酶和淀粉脱分支酶在胚乳、胚和果皮中都有表达,但表达的量有显著差异。5.完整籽粒切片技术在高直链玉米胚乳异质淀粉粒研究中的应用。本研究以直链淀粉含量为19.2%、23.0%、36.4%、41.8%和62.5%的玉米自交系为材料,研究玉米胚乳淀粉的异质性。形态分析表明,玉米淀粉包含单颗粒、双相、聚合体和细长形等不同形态的淀粉粒,其中单颗粒淀粉主要存在于直链淀粉含量为19.2%和23.0%的玉米中,双相淀粉主要存在于直链淀粉36.4%和41.8%的玉米中,而聚合体和细长形淀粉主要存在于直链淀粉含量为62.5%的玉米中。通过对完整籽粒树脂切片的观察发现,随着直链淀粉含量的升高,玉米胚乳的外侧区域和中央区域下部的淀粉粒逐渐变小,逐渐出现聚合体和细长形淀粉;而在胚乳中央区域上部则分布有单颗粒、双相、聚合体和细长形淀粉。在直链淀粉含量为19.2%至41.8%的玉米中,胚乳不同区域淀粉的直链淀粉含量不同,胚乳中央区域上部淀粉的直链淀粉含量比胚乳外侧区域淀粉和中央区域下部淀粉的直链淀粉含量低,且随着直链淀粉含量的升高,这种差异逐渐增大;但胚乳不同区域淀粉的晶体结构类型没有发生变化。在直链淀粉含量为36.4%的玉米中,双相淀粉主要分布在发育胚乳的中央区域,随着颖果的发育,双相淀粉逐渐集中到胚乳中央区域的上部。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S513
【图文】：

淀粉主要是由线性的直链淀粉（含量一般为１８？３３％）和高度分支的支链淀粉（含量一般逡逑为邋６７？８２％）组成的半晶体颗粒（图邋１－１）邋（Ｗａｎｇ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１４；邋Ｗａｎｇ邋＆邋Ｃｏｐｅｌａｎｄ，邋２０１５）。淀粉粒逡逑的结构较为复杂，常被分为５级结构层次（图１－１－Ａ）。第１级和第２级结构是直链淀粉和支逡逑链淀粉分子结构。直链淀粉主要是由ｃｘ－１，４糖苷键连接的ｏｔ－Ｄ－葡萄糖单元组成的线性多糖，逡逑含有少量分支，相对分子质量在１0５￣１0６范围内，聚合度在５００￣６０００范围内（Ｄｅｌｃｏｕｒｅｔａｌ．，逡逑２０１０）。支链淀粉主要由ａ－１，邋６糖苷键连接的线性分支组成，相对分子质量在１０７？１０９之间，逡逑其中的线性分支由ａ－１，邋４糖苷键连接的ａ－Ｄ－葡萄糖单元组成（Ｂｕｌ６ｏｎ邋ｅｔ邋ａｌ．，１９９８）。支链淀粉逡逑侧链进一步分为Ａ链、Ｂ链和Ｃ链（图１－１－Ｂ）。Ａ链是分布在最外层没有分支的侧链，聚逡逑合度在６？１２之间。Ｂ链有一条或多条侧链，根据贯穿簇状结构的层数，又被分为Ｂｌ、Ｂ２、逡逑Ｂ３和Ｂ４链等，其中Ｂ１链聚合度在１３？２４之间，Ｂ２链聚合度在２５？３６之间，Ｂ３和Ｂ４链逡逑聚合度在３７以上（Ｈａｎａｓｈｉｒｏ邋ｅｔ邋ａｌ．

括邋ＡＤＰＧ邋焦a愃峄�酶（ＡＤＰ邋ｇｌｕｃｏｓｅ邋ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ，ＡＧＰａｓｅ）、淀粉合成酶（Ｓｔａｒｃｈ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ，逡逑ＳＳ）、淀粉分支酶（Ｓｔａｒｃｈ邋ｂｒａｎｃｈｉｎｇ邋ｅｎｚｙｍｅ，邋ＳＢＥ）和淀粉脱分支酶（Ｓｔａｒｃｈ邋ｄｅｂｒａｎｃｈｉｎｇ邋ｅｎｚｙｍｅ，逡逑ＤＢＥ）（图１－２）邋（Ｎａｋａｍｕｒａ，邋２００２）。ＡＧＰａｓｅ催化一磷酸葡萄糖（Ｇ１Ｐ）转化为ＡＤＰ葡萄糖逡逑（ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ，ＡＤＰＧ）邋（Ｎａｋａｍｕｒａ，邋２０１５）。因此ＡＧＰａｓｅ催化淀粉合成的起始步骤和关键步骤，逡逑是淀粉合成的限速酶，影响着最终合成淀粉的量（Ｋｏｌｌｅｒ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００２）。ＳＳ通过将ＡＤＰＧ带逡逑来的葡萄糖基团转移到葡聚糖引物的非还原性末端，从而实现葡萄糖链的延伸。ＳＳ能够被逡逑进一步分为颗粒结合淀粉合成酶（Ｇｒａｎｕｌｅ－ｂｏｕｎｄ邋ｓｔａｒｃｈ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ，邋ＧＢＳＳ）和可溶性淀粉合成逡逑酶（Ｓｏｌｕｂｌｅ邋ｓｔａｒｃｈ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ，邋ＳＳＳ）。ＧＢＳＳ主要负责合成直链淀粉，分为ＧＢＳＳＩ和ＧＢＳＳＩＩ两逡逑类，分别在胚乳等Ｉｔ藏组织和叶片等光合组织中发挥功能（Ｆｕｊｉｔａ邋＆邋Ｔａｉｒａ，邋１９９８；邋Ｎａｋａｍｕｒａ邋ｅｔ逡逑ａｌ．，邋１９９８）。ＳＳＳ负责支链淀粉分支链的延伸，能够将可溶性的前体物质ＡＤＰＧ的葡糖基团逡逑转移到ａ－�

本文编号：2814696