玉米种子发育关键基因Emp21的克隆和功能研究

发布时间：2020-09-10 16:06

　　玉米是世界三大粮食作物之一,也是动物饲料和工业生产的重要原料。在世界各地广泛种植,年产量已经超过水稻和小麦,成为第一大粮食作物。玉米种子的发育是影响玉米的产量和品质的重要因素。因此,种子发育关键基因的克隆和功能解析以及种子发育遗传调控网络的构建,对了解玉米种子发育的分子机制具有重要的理论意义,为进一步的分子育种提供重要的理论依据。植物线粒体拥有自己的基因组,保留其原核祖先大约5%的基因。这些基因主要编码氧化磷酸化相关蛋白、核糖体蛋白、tRNA和rRNA。RNA的C→U编辑广泛存在于线粒体和叶绿体的转录本中。其中,在多种植物中,线粒体转录本具有超过300个编辑位点。RNA编辑经常恢复进化保守的氨基酸、形成起始或终止密码子、促进内含子的剪接和提高tRNA的加工效率等。因此,RNA编辑是细胞器(线粒体和叶绿体)基因转录后加工的一个重要过程。虽然,现在已经鉴定到多个参与RNA编辑的因子,但是,这些因子是如何参与该过程的还不太清楚。PPR-DYW类蛋白质是重要的RNA编辑因子,玉米中82个PPR-DYW蛋白。其中只有少数几个蛋白(EMP5、EMP18和PPR2263)的功能被报道。因此,PPR-DYW类蛋白功能的研究对解析RNAC-→U编辑过程以及编辑复合体的组成具有重要意义。本论文中,我们从玉米UniformMu突变体库中分离了一个空果皮突变体emp21-1。emp21-1杂合体自交的果穗分离大约1/4的空果皮籽粒。通过Mu-seq克隆到了 Emp21,Emp21编码一个由11个典型PPR结构域,E1、E2和DYW结构域组成的PPR-DYW类蛋白。我们从UniformMu玉米突变体库中获得了该基因的--个等位突变体emp21-2。连锁鉴定和等位突变分析确定,Emp21是导致emp21-1空果皮表型的突变基因。本论文通过表型观察、蛋白亚细胞定位分析、突变体线粒体转录本中编辑位点检测、线粒体复合物组装和活性分析、Emp21与Emp5的遗传关系分析以及EMP21和EMP5与ZmMORF8相互作用分析等,查明了 EMP21为一个特殊的PPR-DYW蛋白,广泛参与玉米线粒体RNAC→U编辑过程,并与ZmMORF8以及EMP5其它编辑因子互作,在玉米籽粒发育中起关键作用。该研究促进了对PPR-DYW蛋白在玉米胚胎发生和胚乳发育中功能的认识,对解析RNAC→U编辑的分子机制具有一定的理论意义。主要结果如下:1)EMP21的功能缺失严重抑制玉米的胚胎发生和胚乳发育。emp21-1和emp21-2杂合体的自交果穗分离出大约1/4的空果皮籽粒,显示该突变体是核基因隐性突变。授粉后12 d的突变体籽粒明显小于野生型,胚和胚乳都非常小,而野生型的胚胎基本发育出了所有器官原基。突变体的成熟种子呈现严重的干瘪表型。石蜡切片证实emp21的胚胎发生和胚乳发育严重缺失。2)Emp21编码一个线粒体定位的PPR-DYW蛋白。Emp21编码一个典型的PPR-DYW蛋白,由1 1个PPR基序、一个E1、E2和DYW结构域组成。其中DYW结构域具有保守的CDAs-like核心氨基酸(HxE(x)nCxxC)序列。亚细胞定位分析显示EMP21仅定位于线粒体。3)EMP21参与玉米线粒体转录本中81个位点C→U的编辑。利用STS-PCRseq的方法分析了野生型玉米线粒体35个蛋白质编码基因的编辑位点。根据600 Mb的测序数据,在玉米线粒体中共鉴定到了 493个C→U的编辑位点。随后,我们用两个独立的方法(STS-PCRseq和RT-PCR产物测序峰图比对)分析emp21中线粒体编辑位点与野生型的差异,结果显示,在emp21-1 积 emp21-2 中,nad7-77、atp1-1292、atp8-437、mad3-275 和 rps4-870的编辑完全缺失,76个位点的编辑相对于野生型明显降低,其中大部分编辑的缺失导致编码氨基酸的变化。4)EMP21的功能缺失抑制线粒体复合物Ⅰ和Ⅴ的组装和活性。BN-PAGE和Western blotting实验分析显示,emp21-1的线粒体复合物I的组装和活性严重降低,超级复合物Ⅰ+Ⅲ2低于检测水平。同样的,FFo-ATPase全酶以及其亚复合体F'和F1的水解活性和组装在emp21-1中都完全缺失。因此,Emp21的突变严重抑制了玉米线粒体复合物I和V的组装和活性。5)rpl16-458位点大约30%的编辑需要EMP21和EMP5的共同参与。以前的报道发现EMP5参与线粒体转录本上10个位点的编辑,其中的6个位点(rpl16-458、nad9-190、nad9-356、cox3-245、cox3-257 和rps12-71)的编辑在emp21中也存在缺陷。进一步分析显示rpl16-458在emp21-1和emp5-4中分别被编辑80%和73%,而在emp21-1 emp5-4双突变体中下降到35%。这证明rp116-458位点大约30%的编辑需要EMP21和EMP5的共同参与。6)线粒体某些位点的编辑可能涉及EMP21和EMP5与ZmMORF8的相互作用。拟南芥中,MORF/RIP蛋白负责线粒体和叶绿体转录本大部分编辑位点的编辑。玉米MORF蛋白的功能尚无研究。结果显示,EMP21参与编辑的34个位点在拟南芥中对应位点的编辑需要MORF8的功能。同时,EMP5参与编辑的8个位点在拟南芥中对应位点的编辑也需要MORF8。酵母双杂交和荧光双分子互补实验都显示EMP21和EMP5都可以与ZmMORF8直接相互作用。因此,玉米线粒体中某些位点的编辑可能涉及EMP21和EMP5与ZmMORF8的相互作用。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S513
【部分图文】：

模式图,游离核,胚乳发育,分化期

随着中央液泡的增大，细胞质和游离核会分布于胚囊边缘，形成胚乳囊。逡逑细胞化期是指游离核之间产生细胞壁，形成单核的胚乳细胞，直到胚乳细胞充逡逑满整个胚乳囊的时期（图２）。胚乳的细胞化又分为两个时期，第一个是小泡化逡逑期（ａｌｖｅｏｌａｔｉｏｎ），在该时期，首先形成垂直于胚乳细胞壁的背向细胞壁，其包逡逑围在顶层游离核的周围。背向细胞壁朝向中央液泡生长，而平行于中央液泡的逡逑一侧保持开放（图２）邋（Ｌｅｒｏｕｘｅｔａｌ．，２０１４）。当这些小的隔室形成平周壁时，形逡逑成位于胚乳最外层的小的外围细胞。紧接着垂直液泡的方向形成第２－４层次级逡逑的细胞。随后进入分区化期（ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ），该时期朝向胚乳中心由外向内逐层逡逑形成胚乳细胞，直到不同方向形成的细胞连接在一起。通常最后形成的细胞较逡逑大，随后这些细胞再分隔形成小的胚乳细胞（图２）邋（Ｌｅｒｏｕｘｅｔａｌ．，２０１４）。紧接逡逑着，胚乳发育进入分化期（通常授粉后５邋ｄ开始），在该时期，位于胚周围的细逡逑胞分化为胚周细胞（ｅｍｂｒｙｏｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎ

模型图,蛋白,模型,表型

Ｂａｒｋａｎ和Ｓｍａｌｌ基于已有的发现提出了一个可能的工作模型：即ＰＰＲ蛋逡逑白与ＲＮＡ结合，重构ＲＮＡ，暴露出核酸酶切割位点，同时可能招募核酸内切逡逑酶对ＲＮＡ进行切割，完成ＲＮＡ末端的加工（图６）邋（Ｂａｒｋａｎ邋ａｎｄ邋Ｓｍａｌｌ，邋２０１４）。逡逑ＰＰＲ逡逑ＰＰＲＷ＾ｓ－ｅｌｅｍｅｎｔ逦Ｃ／ｓ－ｅｌｅｒ＾ｍ逡逑图６邋ＰＰＲ蛋白重构ＲＮＡ结构的模型（Ｂａｒｋａｎ邋ａｎｄ邋Ｓｍａｌｌ，邋２０１４）。逡逑Ｆｉｇ邋６邋Ｔｈｅ邋ｍｏｄｅｌ邋ｏｆ邋ＲＮＡ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｒｅｍｏｄｅｌｅｄ邋ｂｙ邋ＰＰＲ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋（Ｂａｒｋａｎ邋ａｎｄ邋Ｓｍａｌｌ，逡逑２０１４）．逡逑２．３邋ＰＰＲ蛋白的生物学意义逡逑ＰＰＲ蛋白广泛分布于植物中，并且不同物种之间存在高度一致性。例如进逡逑化树分析显示，超过８０％的拟南芥ＰＰＲ蛋白在水稻中存在直系同源蛋白逡逑（Ｏ＇Ｔｏｏｌｅ邋ｅｔａｌ．，２００８），说明ＰＰＲ蛋白在不同物种中进化保守，很可能具有一致逡逑或相似的功能。通过对不同物种ＰＰＲ突变体研究发现，ＰＰＲ蛋白在植物多个生逡逑长发育阶段和环境适应性方面具有至关重要的作用。其突变体呈现多种表型：逡逑光合作用缺失（通常呈现叶片白化）、叶片发育异常、植株矮小、胚胎和胚乳发逡逑育抑制呈现空果皮表型（ｅｍｐｔｙ邋ｐｅｒｉｃａｒｐ，ｅｍｐ）或者小籽粒表型（ｓｍａｌｌ邋ｋｅｒｎｅｌ，逡逑ｓｍｋ）或者种子发育缺陷（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅｋｅｒｎｅｌ

胚乳发育,胚胎发生,籽粒,果皮

我们从ＵｎｉｆｏｒｍＭｕ玉米突变体库中获得一个空果皮突变体（Ｓｅｔｔｌｅｓ邋ｅｔ邋ａｌ．，逡逑２００７）。子代果穗上大约１／４邋（野生型：空果皮＝８８３：２９６＝２．９８：１）的种子呈现明显逡逑的空果皮（ｅｍｐｔｙｐｅｒｉｃａｒｐ，邋ｅｍｐ）表型（图７Ａ）。进一步，我们取同一果穗上逡逑正常的和空果皮的籽粒，进行种子萌发实验，发现所有正常的籽粒都可萌发，逡逑植株正常生长，并且大约２／３植株的果穗出现表型分离；而所有的空果皮籽粒逡逑均不能萌发，以上说明，导致该表型的突变是核基因隐性突变，并且该突变会逡逑导致种子的败育。逡逑进一步的表型观察发现，授粉后１２邋ｄ的突变体籽粒明显小于野生型。突变逡逑体籽粒具有肉眼不可见的胚和非常小的透明胚乳（图７Ｅ和７Ｆ）；而野生型籽粒逡逑具有明显的胚和胚乳的形态结构，胚乳出现明显的淀粉化（图７Ｂ和７Ｃ）。成熟逡逑的籽粒，突变体出现严重皱缩，呈现透明的薄片状，没有明显的胚和胚乳组织逡逑（图７Ａ和７Ｇ）。因此，我们命名该突变体为ｅｍ／

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