红麻细胞质雄性不育系和保持系microRNA表达谱及功能研究

发布时间：2020-09-15 14:02

　　 microRNAs是一类内源性,长约21nt的非编码小分子RNA。研究表明miRNA作为一类负调控因子广泛参与到植物生长发育的各种进程中。近几年来,高通量测序技术的广泛利用,使植物中大量的miRNA被发现和鉴定,这大大扩展了植物miRNA群体中miRNA的种类和数量。然而,红麻作为重要的韧皮纤维作物,目前还没有关于红麻miRNA的报道。本研究以红麻不育系UG93A和保持系UG93B花药为样品,分别建立small RNA文库,使用高通量测序技术鉴定红麻保守的miRNA和新的miRNA,对不育系和保持系花药中的miRNA的表达谱进行分析,并对它们的靶基因进行预测,最后对红麻miR394a,miRn20,miR167b的功能进行进一步的研究,初步研究结果如下:1.通过高通量测序获得了 42个保守的miRNA和41个新的miRNA。其中有14个miRNA在UG93A和UG93B的花药中差异表达。使用Targetfinder软件对miRNA进行靶基因预测,共预测到280个靶基因,其中差异表达的miRNA的靶基因有79个。通过生物信息学分析,发现这些靶基因大部分为转录因子,如SPL转录因子、GATA转录因子、亮氨酸拉链转录因子、NAC转录因子。此外,还有一些酶,如钙离子转运ATP酶、肉桂醇脱氢酶、糖基转移酶等。2.以红麻H3基因作为内参基因,随机挑选10个miRNA,采用荧光染料嵌合法(qRT-PCR)对高通量测序结果进行验证分析。结果表明,高通量测序结果可靠。3.以DNA为模板克隆miR394a,miRn20,miR167b前体基因序列。使用mfold在线软件分析,发现其前体序列能形成稳定的二级结构。采用双酶切法成功构建miR394a,miRn20,miR167b的过表达载体。4.利用改良的CRISPR/Cas9多靶点载体系统,采用Golden Gate Cloning 方法分别构建 miR394a,miRn20,miR167b 的pYLCRISPR/Cas9 载体,将其分别命名为:pCas9-miR394,pCas9-miRn20,pCas9-miR167。使用酶解法分离红麻叶片原生质体,分别将构建好的三个Cas9载体转入红麻叶片原生质体中进行瞬时表达,测序结果表明:pCas9-miR394,pCas9-miRn20在红麻原生质体中具有靶向切割活性。5.利用烟草的遗传转化体系,使用农杆菌介导叶盘法将构建好的miR394a、miRn20、miR167b过表达载体转入烟草中进行功能研究,通过分子检测获得一批miR394a、miRn20、miR167b转基因植株。观察这3类植株目前的表型,两株miR394a转基因苗表现为植株矮小,叶片小且厚实,叶片颜色深绿,其它转基因苗与野生型相比没有明显差异,营养生长均正常。
【学位单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S563.5
【部分图文】：

红麻,质量检测,核酸,花药

３．１红麻花药基因组ＤＮＡ和ＲＮＡ的质量检测逡逑琼脂糖凝胶电泳结果表明提取的基因组ＤＮＡ纯度高，无蛋白污染，经紫外逡逑分光光度计检测ＤＮＡ的ＯＤ２６０／ＯＤ２８０为１．８１邋（图３－ｌａ）；红麻花药总ＲＮＡ条逡逑带清晰，完整性较好，基本没有降解，无ＤＮＡ污染，经紫外分光光度计检测逡逑ＵＧ９３Ａ邋和邋ＵＧ９３Ｂ邋的总邋ＲＮＡ邋的邋ＯＤ２６０／ＯＤ２８０邋分另ＩＪ为邋１．９３邋和邋１．９１邋（图邋３－ｌｂ），逡逑可用于下一步的实验中。逡逑１２邋Ｍ逡逑■ｐ－逡逑图３－１：红麻核酸质量检测逡逑ａ．

长度分布,长度分布,文库,红麻

逦３４３６９１４逦１５５６３７２８逡逑３．２．２小ＲＮＡ长度分布统计逡逑对两个文库中的Ｃｌｅａｎ邋Ｒｅａｄｓ进行小ＲＮＡ长度分布统计，从图３－２可以看出逡逑这两个小ＲＮＡ文库中的小ＲＮＡ长度分布十分相似，文库中的小ＩＷＡ主要分布逡逑在２１？２４ｎｔ的范围中，其中最丰富的小ＲＮＡ为２４ｎｔ。这些结果与其它植物中报逡逑道的尺寸分布特征一致，如山核桃［９１］、芦笋［９２］。逡逑７００００００逡逑６００００００邋－逦ｒ逡逑５００００００邋－逡逑＾邋４００００００邋－逡逑＾邋３００００００邋－Ｉ逦＿ＵＧ９３Ａ逡逑２００００００邋｜逦ｎ邋－逦ＤＵＧ９３Ｂ逡逑１００００００逦ｎ邋Ｊｌ｜邋，邋ＩＩ逡逑０邋Ｌ邋＾邋Ｍｌ．邋１１１．邋Ｉ…．ｌｌ邋ｌｌｉｌ邋ｌｌ邋ｉｌＭｌ逡逑１８邋１９邋２０邋２１邋２２邋２３邋２４邋２５邋２６邋２７邋２８邋２９邋３０逡逑ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ｌｅｎｇｔｈ邋（ｎｔ）逡逑图３－２：红麻花药ＵＧ９３Ａ和ＵＧ９３Ｂ文库中小ＲＮＡ的长度分布。逡逑Ｆｉｇ．邋３－２：邋Ｌｅｎｇｔｈ邋ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｓｍａｌｌ邋ＲＮＡｓ邋ｉｎ邋ｆｌｏｗｅｒ邋ｂｕｄｓ邋ｏｆ邋ＵＧ９３Ａ邋ａｎｄ邋ＵＧ９３Ｂ邋ｌｉｂｒａｒｉｅｓ邋ｏｆ逡逑Ｋｅｎａｆ．逡逑３．２．３邋ｓＲＮＡ分类注释逡逑利用Ｂｏｗｔｉｅ软件，把测序所得Ｃｌｅａｎ邋Ｒｅａｄｓ分别与ＧｔＲＮＡｄｂ数据库、Ｓｉｌｖａ逡逑数据库、Ｒｅｐｂａｓｅ数据库以及Ｒｆａｍ数据库进行序列比对，然后，把核内小ＲＮＡ逡逑（ｓｎＲＮＡ）、核仁小邋ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核糖体邋ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、转运邋ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）逡逑以及重复序列过滤掉

序列,红麻,最小自由能,细胞质雄性不育系

广西大学顿士学位论文逦红麻细胞质雄性不育系和保诗系ｍｉ邋ｃｒｏＲＭ表达讲及功研究逡逑续表３－４：ｍｉＲＮＡ序列逦长度逡逑ｍｉＲＮＡ逦Ｂ逦Ａ邋ＣＧ％邋ＭＦＥ邋ＭＦＥＩ逡逑ｍｉＲＮＡ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ逦ｌｅｎｇｔｈ逡逑ｈｃａ－ｍｉＲｎ３９逦ＧＧＧＴＴＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＴＴＧ逦２０逦１逦０逦４４．１５逦－２６．４逦０．７８逡逑ｈｃａ－ｍｉＲｎ４０逦ＧＧＡＧＴＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＧＡＡＡＧＡＴＴＴ逦２５逦１３４逦０逦３８．４１逦－５７．８逦１．００逡逑ｈｃａ－ｍｉＲｎ４ｌ逦ＡＴＣＴＧＣＡＴＧＴＴＧＧＡＴＣＴＣＣＴＡＡＧＣ逦２４逦５３逦１０６逦３６．９４逦－２８．５逦７．００逡逑注：Ａ和Ｂ：邋ｍｉＲＮＡ在红麻ＵＧ９３Ａ和ＵＧ９３Ｂ花药的小ＲＮＡ文库中测序得到的ｒｅａｄｓ数；逡逑ＣＧ％：发夹序列Ｇ＋Ｃ碱基百分含量；ＭＦＥ：最小自由能；ＭＦＥＩ：最小折叠自由能系数。逡逑？逦ｓ逦？逦ｓ

【参考文献】