红麻UG93A雄性不育相关基因atp6互作蛋白的鉴定与验证

发布时间：2020-09-15 15:52

　　 红麻(Hibiscus cannabinus L.)是一年生的韧皮纤维植物,具有强大的杂种优势,但前人尚未选育出在生产上有利用价值的雄性不育系和杂交种。2000年,周瑞阳教授在海南冬繁的红麻野生种UG93(引自中国农业科学院麻类研究所)中发现了雄性不育突变系UG93S;2008年,周瑞阳等选育出了世界上首个红麻“三系”杂交种“红优1号”。此后又在UG93品种群体中发现了能保持UG93S雄性不育系UG93B,并选育出了质核同源雄性不育系UG93A,为研究雄性不育核质互作提供了良好的材料。本课题组的前期研究表明,线粒体基因atp6与红麻CMS密切相关;以红麻atp6的CDS序列构建酵母bait载体,通过酵母双杂交文库筛选出了红麻转录因子HcMYC2a和HcMYC2b分别与ATP6互作,但是互作的核心区域尚不清楚。为了验证ATP6与HcMYC2a和HcMYC2b蛋白互作的功能区域,本研究采用Infusion DNA融合方法,以短截的atp6序列分别构建酵母bait载体,以短截HcMYC2a和HcMYC2b序列分别构建酵母prey载体。通过酵母双杂交和双分子荧光互补技术分别验证红麻ATP6与HcMYC2a和HcMYC2b互作的核心功能区域,得出如下主要研究结果:(1)以红麻UG93A和UG93B的cDNA为模板,采用Infusion DNA融合的方法分别构建短截的酵母bait重组载体,分别为pGBKT7-atp6A-1,pGBKT7-atp6A-2,pGBKT7-atp6B-1和pGADT7-atp6B-2;同时构建短截的酵母 prey 重组载体,分别为 pGADT7-HcMYC2a-1,pGADT7-HcMYC2a-2,pGADT7-HcMYC2b-1和pGADT7-HcMYC2b-2。(2)分别将上述酵母bait载体转化Y2H感受态,prey载体转化Y187感受态,通过对不同短截片段的重组质粒进行酵母双杂交检测,研究结果表明atp6A-2与HcMyc2b-1;atp6A-2与HcMYC2b-2;atp6B-1 与HcMYC2b-1 以及atp6B-2与HcMYC2a-1 杂交组合在SD/-Trp-Leu-His-Ade/AbA/X-α-gal的培养基上长蓝斑,说明这些蛋白结构发生相互作用,其所代表的短截片段转录蛋白为互作的核心区域。(3)采用Infusion DNA融合方法构建C端双分子荧光互补载体pSPYCE-atp6A,pSPYCE-atp6B,pSPYCE-HcMYC2aa,pSPYCE-HcMYC2ab,pSPYNE-HcMYC2bb以及N端双分子荧光互补载体pSPYNE-atp6A,pSPYNE-atp6B,pSPYNE-HcMYC2aa,pSPYNE-HcMYC2ab,pSPYNE-H cMYC2bb。(4)将上述重组载体经不同的组合方式分别注射本氏烟草叶片,研究结果表明,ATP6A与HCMyc2bb;ATP6B与HCMyc2aa;ATP6B与HCMyc2ab;以及ATP6B与HCMyc2bb共同注射的烟草叶片均发射黄色荧光信号,表明这些蛋白在烟草叶片中发生互作。
【学位单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S563.5
【部分图文】：

逦的长度为邋９７８邋ｂｐ，邋／／ｃＭｒＣ２ａ－２邋的长度为邋１０４７邋ｂｐ邋的，逡逑Ｚ／ｃＭｙＣ２ｂ－ｌ的长度为１０１１邋ｂｐ，ｉ／ｃＭｒＣ２６－２的长度为８６１邋ｂｐ的基因，扩增结果与预期逡逑的目标条带一致，表明该条带即为扩增目的条带（图３－１）。逡逑图３－１基因ＰＣＲ扩增逡逑Ｍ，邋ＢＭ５０００邋ｍａｒｋｅｒ；泳道邋１－５，分别代表：叫？６／４－厂逡逑ＨｃＭＹＣ２ａ－２ｆ邋ＨｃＭＹＣ２ｂ－ｌ邋ｆ邋ＨｃＭＹＣ２ｂ－２逡逑Ｆｉｇ邋３－１邋Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ邋ｂｙ邋ＰＣＲ邋ｇｅｎｅ逡逑Ｍ，邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ＢＭ２０００邋Ｍａｒｋｅｒ；邋Ｌａｎｅ邋１－８，邋ａｔｐ６Ａ－ｌ，邋ａｔｐ６Ａ－２，邋ａｔｐ６Ｂ－ｌ，邋ｃｉｔｐ６Ｂ－２，邋ＨｃＭＹＣ２ａ－ｌ，邋ＨｃＭＹＣ２ａ－２，逡逑ＨｃＭＹＣ２ｂ－ｌ，邋ＨｃＭＹＣ２ｂ－２．逡逑３．１．２诱饵载体ｐＧＢＫＴ７和ｐＧＡＤＴ７载体的酶切鉴定逡逑用Ｎｄｅｌ和Ｘｍａｌ酶分别对ＰＧＢＫＴ７和ＰＧＡＤＴ７载体进行酶切，结果如图３－２所示，逡逑图Ａ为ＰＧＢＫＴ７载体在酶切前后凝胶电泳结果，目的条带大小与预期一致，图Ｂ泳道逡逑Ｉ为已经连接一段大约２０００邋ｂｐ基因的ＰＧＡＤＴ７载体，泳道２为切除该片段后的ＰＧＡＤＴ７逡逑载体

７５（）ｈｎ邋１逡逑图３－３酵母质粒菌液ＰＣＲ鉴定逡逑Ｍ，ＢＭ２０００邋ｍａｒｋｅｒ；泳道邋１－８，分别代表：含逦扣／？＜１４－２？邋炉６５－７，ｆｌ炉６５－Ｌ邋／／ｃＡ／ＹＣ？ｆｌ－７，逡逑／／ｃＭＴＣ２ｆｌ－二邋／／ｃ：Ｍ７Ｃ２６－厂邋／／ｃＡ／７Ｃ２Ｚｋ？基因的载体逡逑Ｆｉｇ３－３邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｙｅａｓｔｓ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋ｌｉｑｕｉｄ邋ＰＣＲ逡逑Ｍ，邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ＢＭ２０００邋Ｍａｒｋｅｒ；邋Ｌａｎｅ邋１－８，邋ａｔｐ６Ａ－ｌ，邋ａｔｐ６Ａ－２，邋ａｔｐ６Ｂ－ｌ，邋ａｔｐ６Ｂ－２邋ＨｃＭＹＣ２ａ－ｌ，邋ＨｃＭＹＣ２ａ－２，逡逑ＨｃＭＹＣ２ｂ－ｌ，邋ＨｃＭＹＣ２ｂ－２邋Ｃａｒｒｉｅｒ．逡逑３．１．４酵母双杂交Ｍａｔｉｎｇ鉴定逡逑将含序列的酵母ｂａｉｔ重组质粒和含／／ｃＭｙＣ２0和７／ｃＭｒｃ＾序列的酵母ｐｒｅｙ重逡逑组质粒分别转化酵母感受态Ｙ２Ｈ和Ｙ１８７。其中，将含Ｙ２Ｈ的菌株涂布ＳＤ／－Ｔｒｐ的营养逡逑缺陷性培养基，挑单克隆，培养菌液与含Ｙ１８７的菌株涂布的ＳＤ／－Ｌｅｕ营养缺陷性培养逡逑基，挑单克隆的培养菌液进行Ｍａｔｉｎｇ反应，取Ｍａｔｉｎｇ反应后菌液在４０ｘ的显微镜下进逡逑行观察

２０００邋ｍａｒｋｅｒ；泳道邋１－８，分别代表：含逦扣／？＜１４－２？邋炉６５－７，ｆｌ炉６５－Ｌ邋／／ｃＡ／Ｙｆｌ－二邋／／ｃ：Ｍ７Ｃ２６－厂邋／／ｃＡ／７Ｃ２Ｚｋ？基因的载体逡逑Ｆｉｇ３－３邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｙｅａｓｔｓ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋ｌｉｑｕｉｄ邋ＰＣＲ逡逑ｓｅｎｔ邋ＢＭ２０００邋Ｍａｒｋｅｒ；邋Ｌａｎｅ邋１－８，邋ａｔｐ６Ａ－ｌ，邋ａｔｐ６Ａ－２，邋ａｔｐ６Ｂ－ｌ，邋ａｔｐ６Ｂ－２邋ＨｃＭＹＣ２ａ－ｌ，邋ＨｃＭｂ－ｌ，邋ＨｃＭＹＣ２ｂ－２邋Ｃａｒｒｉｅｒ．逡逑母双杂交Ｍａｔｉｎｇ鉴定逡逑含序列的酵母ｂａｉｔ重组质粒和含／／ｃＭｙＣ２0和７／ｃＭｒｃ＾序列的酵母ｐ分别转化酵母感受态Ｙ２Ｈ和Ｙ１８７。其中，将含Ｙ２Ｈ的菌株涂布ＳＤ／－Ｔｒｐ养基，挑单克隆，培养菌液与含Ｙ１８７的菌株涂布的ＳＤ／－Ｌｅｕ营养缺陷克隆的培养菌液进行Ｍａｔｉｎｇ反应，取Ｍａｔｉｎｇ反应后菌液在４０ｘ的显微呈现为三叶草或者米老鼠图案的二倍体细胞，如图３－４所示：逡逑

【参考文献】

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本文编号：2819167