水稻弱势早衰突变体wls5的鉴定及其基因克隆

发布时间：2020-09-16 09:59

　　弱势和早衰都是水稻的异常生长现象,这种现象最终会导致水稻严重减产。虽然这些异常生长背后的分子机制目前已经得到广泛研究,但弱势和早衰是由复杂的遗传调控网络控制的,仍需要进一步研究。在本研究中,我们通过EMS(甲基磺酸乙酯)诱变籼稻品种93-11获得了一个弱势早衰突变体,暂时将其命名为wls5(weakness and leaf senescence5)。wls5突变体表现出一系列生长弱势的表型。与野生型相比,wls5突变体的株高显著降低,穗长变短,穗粒数减少,结实率下降,单株产量降低。组织学分析表明,wls5突变体的生长弱势是由细胞长度变短引起的。其次,wls5在不同的生长阶段表现出不同程度的早衰现象。与野生型相比,wls5突变体在早期萌发阶段并未表现出衰老;播种15天后,叶尖有淡淡的黄色;随后wls5的黄斑扩大并加剧;然而,拔节期时,其新叶变为绿色,然后在籽粒灌浆期再次表现出明显的衰老。生理分析和透射电镜的结果表明,wls5的叶绿体发育异常,叶绿体数量显著减少,叶绿体变小,叶肉细胞中嗜锇颗粒明显增多;由于wls5突变体中积累了过量的活性氧,导致叶片中的叶绿素严重降解。扫描电镜观察结果表明,与野生型相比,wls5突变体叶片的气孔密度更大,同时气孔的长度和宽度变小。通过植物激素的测量,我们发现wls5突变体的内源植物激素紊乱。与野生型相比,wls5中的水杨酸(SA)、赤霉素(GA3)和脱落酸(ABA)含量显著降低,而吲哚乙酸(IAA)含量显著升高。RNA-seq结果表明,参与氧化还原酶活性、氧化还原过程、对脱落酸的反应、多细胞生物发育以及脱落酸激活的信号传导途径等衰老相关基因的表达水平在野生型和wls5突变体之间存在显著差异。遗传分析表明,wls5受单个隐性核基因控制。利用图位克隆的方法,我们将WLS5精细定位到5号染色体上的29 kb的区间内。通过对野生型和wls5进行测序,我们发现LOC_Os05g04900的第一个外显子中有3个碱基缺失,导致其表达蛋白中赖氨酸的缺失。在Nipponbare背景下敲除LOC_Os05g04900基因,敲除后的植株表现为叶片早衰,表明该基因是WLS5的候选基因。通过实时荧光定量PCR实验,WLS5在水稻的不同组织内均有表达,在叶片、茎秆和根中表达量较高,而在幼穗、胚和种子中表达量较低。在该研究中,我们在水稻中鉴定了一个涉及植物生长发育和叶片早衰的新突变体。编码表达蛋白的LOC_Os05g04900是WLS5的候选基因。对wls5突变体的进一步分子研究将揭示其在植物生长和叶片衰老过程中的功能作用。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S511
【部分图文】：

表型,野生型,突变体,每穗粒数

17图 3.1 野生型和 wls5 突变体之间的表型比较Figure 3.1 Comparison of phenotype between wild-type and wls5 plants生型（93-11）和 wls5 的植株表型。Bar = 40 cm。（B，C）野生型和 wls5 的株高 20 株。**表示 P < 0.01（T 检验）。（D）野生型和 wls5 的穗部表型。Bar = 3 cm。、每穗粒数、结实率和单株产量的统计分析。各测量 20 个穗。**表示 P < 0.01（T(93-11) and wls5 plants at maturity. Scale bar = 40 cm. (B, C) Statistical analysis of plann wild-type and wls5 plants. Twenty plants were measured. Error bars indicate SD; **P <otype of panicle between wild-type and wls5 plants. Scale bar = 3 cm. (E-H) Statistical aper panicle, setting rate and yield per plant between wild-type and wls5 plants. Twenr bars indicate SD; **P < 0.01 (Student's t test).

野生型,茎秆,细胞长度

中国农业科学院硕士学位论文第三章结果与分析植物器官的大小是通过细胞分裂和细胞生长调节细胞数目和细胞大小来共同决定的（Krizek，2009）。为了研究 wls5 突变体器官变小的原因，我们对抽穗期的野生型和 wls5 进行石蜡切片。通过观察石蜡切片的结果并进行比较发现，wls5 的第二节间的横向切面比野生型的小（图 3.2A，B）。通过统计分析表明，wls5 的细胞数仅为野生型的 89.2％（图 3.2C）。第二节间的纵向切片显示，wls5 的细胞大小发生显著的变化（图 3.2D）。wls5 的细胞长度仅为野生型的 55.9％，而wls5 和野生型的细胞宽度并无显著差异（图 3.2E，F）。以上结果表明，wls5 整体长势较弱是由于细胞长度变短引起的。

野生型,叶片衰老,表型,分蘖期

图 3.3 wls5 叶片衰老的鉴定Figure 3.3 Identification of leaf senescence in wls5A）分蘖期，野生型（93-11）和 wls5 的植物表型。Bar = 10 cm。（B）野生型和 wls5 的叶片表型。Bar = 2 cC）野生型和 wls5 叶片中的叶绿素含量。10 个生物学重复。**表示 P < 0.01（T 检验）。（D）野生型和 w片的光合速率。15 个生物学重复。**表示 P < 0.01（T 检验）。（E）野生型和 wls5 植物中叶绿素降解相关（SGR 和 RCCR1）（左）和衰老相关基因（Osh36 和 Osl57）（右）的表达。3 个生物学重复。**表示 P < 0T 检验）。（F）苗期，野生型和 wls5 叶片的透射电镜观察。C-叶绿体；OG-嗜锇颗粒；SG-淀粉粒；G-基粒。) Wild-type (93-11) and wls5 plants at the tillering stage. Scale bar = 10 cm. (B) Leaf phenotype of wild-type and wlants. Scale bar = 2 cm. (C) Chlorophyll content of leaves in wild-type and wls5 plants. Error bars indicate SD, n = *P < 0.01 (Student's t test). (D) Photosynthesis rate of leaves in wild-type and wls5 plants. Error bars indicate SD, 5. **P < 0.01 (Student's t test). (E) Expression of CDGs (SGR and RCCR1) (Left) and other SAGs (Osh36 and Oslight) in wild-type and wls5 plants. Error bars indicate SD, n = 3. **P < 0.01 (Student's t test). (F) Transmissectron microscopy analysis of senescence leaves of wild-type and wls5 plants at seedling stage . C, chloroplast; Osmiophilic granule; SG, starch granule; G, grana thylakoid.我们还在整个生长期内连续监测了 wls5 突变体的叶片衰老表型，并发现 wls5 在不同的生

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