基于RNA-Seq的干旱胁迫下野生大豆转录组分析与基因克隆

发布时间：2020-09-21 17:55

　　 研究野生大豆的抗旱机制和获取抗旱型基因,对于改良大豆品质有重要意义。本论文以实验室经过多年筛选的抗旱性较强的野生大豆永46为试验材料,用20%PEG6 000模拟干旱,分别在处理0h、6h、12h、24h和48h剪取野生大豆叶片,提取总RNA,进行转录组测序。分析结果表明,大量的差异表达基因响应干旱胁迫。从中筛选了5个基因进行功能验证,为野生大豆抗旱基因挖掘和重要代谢途径确定提供了数据基础。主要研究结果如下:1.转录组测序共获得39 183条转录本,5个时期共有的转录本为27 875条。其中在KEGG数据库中有注释的转录本有24 656条,在GO数据库中有注释的转录本有19 780条,在NR数据库中有注释的转录本有35 534条,其中3个数据库均有注释的转录本有16 937条,都不能注释的转录本有1 867条。2.选取了7个基因进行了荧光定量分析来确定转录组测序结果的可靠性。每个基因验证5个时期。其中4个基因每个时期的RT-PCR结果与RNA-Seq结果的表达趋势完全一致;2个基因的比对结果基本一致,1个基因表达趋势完全相反,一致度可达77%。3.通过对5个不同时期差异表达基因分析,处理12h差异表达基因最多,为12 289个;处理48h最少,为2 841个。在4个处理样本中均表现为差异表达的基因数有5 346个,在Pathway代谢注释的途径中富集程度最高的途径有6条。4.根据RNA-Seq结果获得的基因表达量和功能注释结果,结合生物信息学分析,共筛选了5个抗旱候选基因。对候选基因进行了克隆,在NCBI完成注册(注册号:MH932277-MH932281)。通过对核酸序列的同源性进行比较,克隆序列与野生大豆或大豆同源性较高,在进行氨基酸结构分析时发现,克隆蛋白多为亲水性蛋白。5.对5个基因进行了过表达验证,其中对干旱胁迫最相关的基因是glysoja_008314。
【学位单位】：河北科技师范学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S565.1
【部分图文】：

图 2-1 RNA-Seq 试验流程图Fig.2-1 Principle and procedure of RNA-Seq1.去除杂质数据 测序原始图像转化后形成的序列数据称为原始数据（raw data）。数据过滤（filtering）后方可进行测序。过滤后的数据称为过滤数据（clean data）。过滤掉的转录本包括含有 adapter 序列的转录本，N 比例大于 10%的转录本以及低质量的转录本。过滤后的数据将进行数据质量分析（QC）。2.比对参考序列 将过滤后的转录本分别比对到大豆 william82 基因组和基因序列（alignment with gene/genome reference），根据基因组可视化（Genome alignment visualization）、统计比对率（map rate statistics）、转录本在参考序列上的分布情况（distribution of reads on gene）、测序饱和度分析（Sequencing saturation）以及转录本在参考基因组上的分布情况（distribution of reads and genes on genome）结果判断片段的质量（QC ofalignment）。通过的 clean reads 进行下一步的分析。

第二章 野生大豆干旱胁迫下的转录组测序（RNA-Seq）分析续表Continue样品 Sample 0 h 6 h 12 h 24 h 4唯一定位序列Unique Match8 310 074 8 252 163 8 621 802 8 302 300 8 086 8多定位序列Multiple Match2 332 172 2 459 240 1 886 329 2 371 174 2 301 62.3.3 测序饱和度分析测序饱和度分析可以在一定程度上判断测序数据量是否满足要求。5 个同时期的样品测序量在 12500k 后曲线趋于平缓（图 2-2），表明此时测序达到了饱和状态，测序量可以达到要求。A B

图 2-3 各时期的序列数量统计维恩图Fig.2-3 Venn diagram of unigenes under the different p表达基因定义对各个时期涉及的所有显著差同时期两两比较下的差异基因个数如图 2-4。比较，处理 12h 时差异表达基因个数最多，少，且处理 12h 差异上调基因最多，处理 6h两两比较中，与处理 12h 比较时差异基因最12h 比较时差异上调基因最多，处理 24h 和 4因最少；处理 24h 和 48h 比较时差异基因个

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本文编号：2823807