冬小麦TaG6PDH和Ta6PGDH响应低温胁迫的生理分子机制

发布时间：2020-09-22 13:19

　　 小麦(Triticum aestivum)是我国重要的粮食作物之一,其高产、稳产对国家粮食安全和农业可持续发展极其重要。低温胁迫是一种主要的非生物胁迫,会严重影响小麦的生长与发育,从而降低其产量。东北农业大学自主培育出了能克服黑龙江地区高寒气候条件的强耐寒冬小麦品种“东农冬麦1号”(Dn1)(返青率≥85%),探讨其抗寒机制至关重要。磷酸戊糖途径(PPP)是真核生物NADPH的主要来源,并为生物合成提供代谢中间体。当植物遭受非生物胁迫时,PPP途径可以维持细胞的氧化还原平衡,因此,该途径是植物抵抗非生物胁迫的关键途径。6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH,EC.1.1.1.49)和6-磷酸葡糖酸脱氢酶(6PGDH,EC.1.1.1.44)是磷酸戊糖途径的关键酶。本研究以大田自然降温条件下种植的Dn1为基础材料,测定4个温度节点(5℃、0℃、-10℃、-25℃)下分蘖节和叶片中TaG6PDH与Ta6PGDH的活性及基因表达量,并从Dn1中分离TaG6PDH和Ta6PGDH基因,在拟南芥中过表达,以探讨其响应低温胁迫的生理与分子机制。实验结果如下:(1)生物信息学分析结果显示,冬小麦TaG6PDH和Ta6PGDH蛋白定位于细胞质中,与乌拉尔图小麦和山羊草亲缘关系较近,并均含有底物结合位点和NADP~+结合位点。(2)随着温度降低,冬小麦分蘖节和叶片的TaG6PDH和Ta6PGDH的表达量逐渐升高,且分蘖节中两种基因表达量的变化倍数高于叶片;外源ABA显著提高低温胁迫下TaG6PDH和Ta6PGDH的表达量。(3)冬小麦分蘖节中,TaG6PDH和Ta6PGDH的活性随着温度降低而升高,在-10℃达到峰值,但-25℃时又降低到5℃对照水平。叶片中,两个酶的活性随着温度的降低并无显著增加,但温度降到-25℃时,活性急剧下降。外源ABA显著提高低温胁迫下TaG6PDH和Ta6PGDH的活性。(4)成功构建了TaG6PDH和Ta6PGDH的超表达载体,转化拟南芥获得超表达植株。(5)对野生型、突变体和超表达拟南芥植株进行室内低温胁迫(4℃、0℃、-10℃)处理,TaG6PDH和Ta6PGDH的超表达植株都能够在低温胁迫后恢复到正常的生长状态。生理指标测定结果显示,在相同的低温下超表达植株与野生型和突变体相比有较高的叶绿素含量、较低的MDA含量及伤害率。DAB和NBT染色结果也显示出超表达植株能够在低温胁迫下产生更少的活性氧(ROS),从而减少氧化胁迫对植株的伤害。(6)低温胁迫下,拟南芥超表达植株中TaG6PDH、Ta6PGDH表达量在0℃和-10℃显著升高,且TaG6PDH超表达植株中内源At6PGDH基因表达量显著高于野生型;同样,Ta6PGDH超表达植株中内源AtG6PDH基因的表达量也显著高于野生型。(7)0℃和-10℃下,TaG6PDH超表达植株中G6PDH活性显著高于野生型和突变体;同样,Ta6PGDH超表达植株中6PGDH活性也显著高于野生型和突变体。本研究初步证实了冬小麦胞质TaG6PDH和Ta6PGDH响应低温胁迫,在拟南芥中超表达TaG6PDH和Ta6PGDH能够增强植株的抗低温能力。本实验结果为解析Dn1抗寒机制提供了相应的理论依据,也为冬小麦抗寒分子育种奠定了理论基础。
【学位单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S512.11
【部分图文】：

图 1-1 磷酸戊糖途径示意图Figure 1-1 The sketch map of pentose phosphate pathway植物非生物胁迫泛存在于植物、动物和原核生物中，G6PDH 催化过程为生物氮同化，还提供戊糖用于核酸合成[89,90]。一般来说，G6PDH检测到，因此 G6PDH 可分为细胞质 G6PDH（Cy-G6PDH）和y-G6PDH 占据了植物体中该酶活性的 60%-85%[92]，并且 C6PDH 具有相似的动力学及分子性质。通常 Cy-G6PDH 对还活性受 NADPH/NADP+比值的调节，并被 NADPH 竞争性抑 活性受糖传感机制的调节，这种机制将根据植物中碳的状态氨基酸的合成[97]。有研究显示，拟南芥在盐胁迫下，为了满酶激酶 3（ASKα）能够磷酸化 Thr-467，激活 Cy-G6PDH[98通过成熟蛋白和信号肽的比对发现了两种不同亚型的质6PDH），它们从共同的祖先基因进化而来。P1-G6PDH 和 P异，P1-G6PDH 为（I/V/L）X（S/T/K）↓（S），而 P2-G6PDH 为（。P1-G6PDH 定位于植物叶绿体，P2-G6PDH 几乎在所有植物化阶段提供还原力[100]。光照下，为了避免无效的循环，P1-合作用的效率；黑暗下，抑制被解除，PPP 途径被激活并释

结果与分析3 结果与分析3.1 低温胁迫下 TaG6PDH 和 Ta6PGDH 表达分析及酶活测定3.1.1 Dn1 总 RNA 提取及 cDNA 第一条链的合成用植物 RNA 提取试剂盒提取 Dn1 四个温度（5℃、0℃、-10℃、-25℃）下分蘖节及叶片的总 RNA。随后使用超微紫外分光光度计检测 RNA 浓度及质量，检测结果 RNA 浓度、质量均在合格范围内，同时也通过琼脂糖凝胶电泳检测样品 RNA 的质量（图 3-1），实验结果也符合正常标准，可以用于后续实验。再利用相应的药品进行反转录，获得每一个样品的cDNA。A B

图 3-4 低温胁迫下 G6PDH 在分蘖节（A）和叶片（B）中的活性及 6PGDH 在分蘖节（C）和叶片（D）中的活性Figure 3-4 The activities of G6PDH in tillering node (A) and leaf (B) and the activities of6PGDH in tillering node (C) and leaf (D).2 目的基因的克隆及生物信息学分析.2.1 Dn1 中 TaG6PDH 和 Ta6PGDH 的克隆运用 Primer5.0 设计 TaG6PDH、Ta6PGDH 基因克隆引物（表 3-2），以-10℃分蘖节 cDNA模板，利用 PCR 技术分别对 TaG6PDH、Ta6PGDH 基因 CDS 序列进行克隆（图 3-5），PCR物用琼脂糖凝胶电泳检测，泳道 1、2 为 TaG6PDH 目的条带，泳道 3、4 为 Ta6PGDH 目的带，长度分别为 1530 bp 和 1440 bp。回收目的条带，对目的基因进行测序，测序结果用NAMAN 进行比对，比对结果如图 3-6 所示，两条克隆所得基因与小麦数据库中基因序列似度达 99.61%和 98.13%，说明已成功获得 Dn1 中 TaG6PDH 和 Ta6PGDH 基因 CDS 序列。表 3-2 TaG6PDH 和 Ta6PGDH 基因克隆引物Table3-2 TaG6PDH and Ta6PGDH cloning primers

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